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篇1

【關(guān)鍵詞】 組蛋白脫乙?；?；血管緊張素Ⅱ；心肌細(xì)胞；肥大；反義脫氧寡核苷酸

心肌細(xì)胞肥大是一種復(fù)雜的、多種因素參與調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）在內(nèi)的多種化學(xué)因素、多種機(jī)械刺激的作用都有可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的肥大。盡管對(duì)于其中的內(nèi)在機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為在心臟肥大的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中，組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）可能是一個(gè)重要的終極靶點(diǎn)〔1〕。HDACs分為三類，其中Ⅰ類HDACs被推斷認(rèn)為有可能對(duì)于心肌肥厚發(fā)揮著促進(jìn)作用，但目前有待于進(jìn)一步明確〔2〕。本課題組以Ⅰ類HDACs之一——組蛋白脫乙?；?(HDAC2）為著眼點(diǎn)，以AngⅡ刺激心肌細(xì)胞造成肥大，給予HDAC2反義脫氧寡核苷酸和HDACs抑制劑——丙戊酸進(jìn)行干預(yù)。通過(guò)觀察HDAC2在這一過(guò)程中的變化，以求證其對(duì)心肌細(xì)胞肥大的促進(jìn)作用；同時(shí)也可證明丙戊酸作為臨床上常用的一種抗癲癇藥物，對(duì)于心肌肥厚有一定的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

新生1～3 d Wistar乳鼠，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM，美國(guó)Hyclone公司。兔多克隆抗體人HDAC2（H54）及羊抗兔抗體，美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。丙戊酸鈉，美國(guó)Sigma公司。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑，TakaRa公司。相差光學(xué)顯微鏡，Nikon eclipse ts100。紫外透射檢測(cè)分析儀FS312，上海復(fù)生生物工程研究所。RTPCR引物和HDAC2錯(cuò)義脫氧核苷酸序列由北京奧科公司合成。FuGENE 6，瑞士Roche公司。

1.2 FuGENE 6轉(zhuǎn)染反義脫氧寡核苷酸

按照FuGENE 6說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。于無(wú)菌試管中預(yù)先放入97 μl無(wú)血清培養(yǎng)液，加入FuGENE 6 3 μl，室溫下孵育5 min。加入HDAC2反義脫氧寡核苷酸 2 μg形成混合物，混勻后均于室溫下孵育30 min。反義寡聚脫氧核苷酸(ASODN)序列為5′GATGGGAAGGAGAGCAGCACAG3′。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

取新生2～3 d Wistar乳鼠心臟，放入含無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液的平皿中。去除心房心包膜及附屬大血管后，0.25%胰酶反復(fù)消化、取上清，將收集的上清液用2 000 r/min離心10 min。棄上清，在離心管中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，將細(xì)胞重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。按細(xì)胞數(shù)2×105/ml接種于6孔板培養(yǎng)。細(xì)胞分為正常對(duì)照組、肥大組、反義組和丙戊酸組。肥大組、反義組和丙戊酸組均加入10-5 mol/L AngⅡ，AngⅡ終濃度為2×10-7 mol/L；反義組加入于上述HDAC2反義脫氧寡核苷酸混合物；丙戊酸組加入丙戊酸，其終濃度為10-3mol/L；正常對(duì)照組僅加入等量無(wú)血清培養(yǎng)液。加入AngⅡ后12 h和24 h進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.4 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞面積變化

各組均隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取10個(gè)心肌細(xì)胞，在1 600倍下應(yīng)用Motic Images 1.3軟件測(cè)量心肌細(xì)胞面積，計(jì)算平均值。

1.5 RTPCR檢測(cè)HDAC2 mRNA表達(dá)

以Trizol (Invitrogen公司產(chǎn)品)提取心肌細(xì)胞中的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA純度和含量，按照TaKaRa RTPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。HDAC2基因引物序列：上游：5′GCT CGA TGT TGG ACG TAT GAG AC3′；下游：5′ACC TCC TTC ACC TTC ATC CTC AG3′；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為364 bp。βactin基因引物序列：上游：5′TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG3′；下游：5′GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG3′；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為764 bp。逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，4℃ 貯存。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃貯存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，經(jīng)紫外透射分析拍攝電泳條帶。以βactin為內(nèi)參照，結(jié)果以HDAC2/βactin比值表示。

1.6 免疫組化法檢測(cè)HDAC2蛋白表達(dá)

取出各組無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)玻片，無(wú)菌冷丙酮固定20 min。置于0.3% H2O2中30 min抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。加入一抗(兔多克隆HDAC2抗體)4℃過(guò)夜。加入二抗（羊抗兔抗體），室溫下2 h。DAB顯色。蘇木素復(fù)染。乙醇脫水，二甲苯脫乙醇，封片。鏡下觀察，HDAC2以細(xì)胞核棕黃色為陽(yáng)性。采用鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，分別計(jì)算HDAC2表達(dá)陽(yáng)性心肌細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞面積的改變

在1 600倍下，正常對(duì)照組、反義組和丙戊酸組心肌細(xì)胞面積在12 h、24 h點(diǎn)均低于肥大組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但反義組和丙戊酸組心肌細(xì)胞面積仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。反義組和丙戊酸組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。表1 各組心肌細(xì)胞面積的檢測(cè)（略）

2.2 HDAC2 mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組、反義組和丙戊酸組心肌細(xì)胞HDAC2 mRNA表達(dá)在12 h、24 h點(diǎn)均低于肥大組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但反義組和丙戊酸組仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。反義組和丙戊酸組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。表2 各組心肌細(xì)胞HDAC2 mRNA的表達(dá)(略)

2.3 HDAC2蛋白表達(dá)

正常對(duì)照組、反義組和丙戊酸組心肌細(xì)胞HDAC2蛋白表達(dá)在12 h、24 h點(diǎn)均低于肥大組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但反義組和丙戊酸組仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。反義組和丙戊酸組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。表3 各組心肌細(xì)胞HDAC2蛋白檢測(cè)結(jié)果(略)

3 討論

蛋白的乙酰化和去乙?；堑鞍谆钚哉{(diào)節(jié)的一種重要形式，通過(guò)乙?；蛉ヒ阴；梢愿淖?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)或者是轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的活性。真核生物染色質(zhì)的基本單位——核小體是由核心組蛋白和DNA組成，核心組蛋白的乙?；c去乙?；腔虮磉_(dá)過(guò)程中重要的調(diào)控方式之一〔3〕。催化組蛋白去乙?；拿釜步M蛋白脫乙?；阜譃槿?，這三類HDACs中，僅前兩類與核心組蛋白的去乙?；嚓P(guān)，Ⅲ類HDACs則無(wú)此作用，因此目前認(rèn)為僅前兩類參與對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)〔4，5〕。研究結(jié)果顯示Ⅱ類HDACs在心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中發(fā)揮一定的抑制作用〔2，6〕，并推斷Ⅰ類HDACs發(fā)揮著促進(jìn)作用〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Ⅰ類HDACs在這一過(guò)程中有一定的促進(jìn)作用，與其他學(xué)者在大體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)果是一致的〔8〕。

目前對(duì)于HDAC2在心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用的具體機(jī)制尚未完全明確，結(jié)合其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及先前研究結(jié)果推測(cè)，HDAC2對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)參與輔阻遏物的形成而實(shí)現(xiàn)的。在輔阻遏物mSin3中，主要成分包括核受體輔助抑制因子(NcoR)、甲狀腺沉默介導(dǎo)因子(SMRT)、Sin3、組蛋白去乙酰化酶(HDAC2)。該復(fù)合物與核受體、Mad/Max等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并且通過(guò)Sin3募集HDAC2到特定基因的調(diào)控區(qū)，通過(guò)對(duì)組蛋白去乙?；l(fā)揮抑制作用。另外，HDAC2與一種特殊的心臟特異性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——Hop蛋白（Homeodomain only protein）有著密切關(guān)切〔7〕。具體內(nèi)在關(guān)聯(lián)尚有待于深入研究。

另外，本文結(jié)果表明了HDAC2反義脫氧寡核苷酸和HDAC抑制劑對(duì)于心肌細(xì)胞肥大的抑制作用。丙戊酸是20世紀(jì)70年代開(kāi)始應(yīng)用于臨床的一種廣譜抗癲癇藥，多年的臨床實(shí)踐證實(shí)了丙戊酸的良好耐受性。其治療癲癇的作用機(jī)制為增強(qiáng)γ氨基丁酸(GABA)的抑制作用，穩(wěn)定膜的興奮性，主要用于各種類型的癲癇發(fā)作，亦可用于癲癇持續(xù)狀態(tài)。但是直到近些年才發(fā)現(xiàn)丙戊酸還是一種選擇性Ⅰ類HDACs抑制物，而且這一抑制作用與其治療性抗癲癇作用不同。其對(duì)心臟肥大的抑制作用有著重要的意義，對(duì)于這方面的研究有必要進(jìn)一步從臨床研究的角度加以證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

1 Frey N，Katus HA，Olson EN，et al.Hypertrophy of the heart：a new therapeutic target〔J〕? Circulation，2004;109（13）:15809.

2 Zhang CL，McKinsey TA，Chang S，et al.Class Ⅱ histone deacetylases act as signalresponsive repressors of cardiac hypertrophy〔J〕.Cell，2002;110(4):47988.

3 劉紅利，陳燕.組蛋白乙?；?去乙酰化及其在惡性血液病中的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志，2003;9(2):1468.

4 Simpson P.Stimulation of hypertrophy of cultured neonatal rat heart cells through an alpha 1adrenergic receptor and induction of beating through an alpha 1and beta 1adrenergic receptor interaction.Evidence for independent regulation of growth and beating〔J〕.Circ Res，1985;56（6）:88494.

5 Izumo S，NadalGinard B，Mahdavi V.Protooncogene induction and reprogramming of cardiac gene expression produced by pressure overload〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA，1988;85(2):33943.

篇2

一氧化氮合酶

Role of the tetrahydrobiopterin in Myocardial preconditioning: Possible Involvement of Mitochondrial KATP Channels and Nitric Oxide Synthase

ZHONG Biao1, ZHONG Huan-qing2, CHEN Hai-sheng2.

1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou, Guangdong Province, 516000, China

2.Department of Cardiovascular Surgery, Gaozhou People’s Hospital, Maoming, Guangdong Province, 525200, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of tetrahydrobiopterin(BH4),5-hydroxydecanoate (5-HD) and Nω- nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on langendorff rabbit heart model. MethodsSixty-four mature rabbits were randomly divided into four groups. The hearts in vitro removed to Langendoff equipment, then perfused with different buffer solution base on the Krebs-Henseleit buffer(KHB) for 30min. Then cardiac arrest was induced for 30min followed by 60min reperfusion. Coronary flow(CF) was recorded. Coronary effluent solution was collected for CK measurion. The dynamic change of myocardial NO content was measured. ResultsBy the treatment with BH4, CF was significantly increased, and CK was decreased than other groups after reperfusion(P

【Key words】 Tetrahydrobiopterin; Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury; ATP-Sensitive Potassium Channels; Nitric Oxide Synthase

BH4是所有NOS同功酶的輔助因子，具有穩(wěn)定NOS結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定NOS活性二聚體、增加L-精氨酸和NOS結(jié)合力、促進(jìn)NO的合成與釋放等作用，與內(nèi)皮功能密切相關(guān)[1,2]。外源性補(bǔ)充BH4能保護(hù)缺血再灌注心肌[3]，但是具體作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)、5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydecanoate, 5-HD) 和左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)對(duì)缺血再灌注心臟冠脈流量（coronary flow, CF）、一氧化氮(nitric oxide, NO)含量、肌酸激酶（creatine kinase, CK）的影響，研究線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP) 、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)對(duì)四氫生物蝶呤減輕心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）作用的影響，探討四氫生物蝶呤保護(hù)缺血再灌注心肌作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成熟的大白兔64只(廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，雄雌各半)，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分入對(duì)照組（組Ⅰ）和BH4組（組Ⅱ）、BH4+ L-NAME組（組Ⅲ）、BH4+5-HD組（組Ⅳ），每組16只。

1.2 主要儀器和試劑

自制Langendorff離體心臟灌注裝置，全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司, CX-4 型)，L-NAME、5-HD、BH4購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司。

1.3 離體心臟Langendorff灌流模型

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，肝素鈉(150 IU/kg)抗凝后，迅速開(kāi)胸取出心臟，立即浸入4℃ K-H液中，排盡殘血，連接于Langendorff模型灌注裝置上，以37℃ K-H液經(jīng)主動(dòng)脈插管逆行灌注30 min，灌注壓恒定為70 cm H2O，灌注液持續(xù)通入95%O2-5%CO2混合氣(流量3 L/min)。停搏前20 min BH4+ L-NAME組（組Ⅲ）、BH4+5-HD組（組Ⅳ）分別用加入L-NAME、5-HD的K-H液進(jìn)行灌注10min。停搏前10 min BH4組（組Ⅱ）、BH4+ L-NAME組、BH4+5-HD組均用加入BH4的K-H液灌10 min。經(jīng)30 min灌流后，灌注40 ml 4℃ St. Thomas心臟停搏液進(jìn)行停搏，時(shí)間30 s。心臟停跳期間溫度保持在37℃~38℃。心臟缺血30 min后，以37℃ K-H液再灌注60 min。

BH4、5-HD、L-NAME最終濃度為10、100、100 μmol/L。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 在灌注10min、再灌注10 min、再灌注30 min、再灌注60 min4個(gè)時(shí)點(diǎn)收集冠脈流出液記錄冠脈流量CF。

1.4.2 全自動(dòng)生化分析儀分析上述4個(gè)時(shí)點(diǎn)冠狀動(dòng)脈流出液CK含量。

1.4.3 分別取缺血30 min、再灌注60 min的心室肌，硝酸還原酶法測(cè)定心肌組織NO含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)注差（ ±s）表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間、組內(nèi)數(shù)據(jù)比較均用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1與對(duì)照組相比，用含BH4的K-H液灌注的組Ⅱ再灌注后的CF、心肌組織NO含量增加(P

2.2使用含NOS抑制劑L-NAME（組Ⅲ）或mitoKATP抑制劑5-HD（組Ⅳ）預(yù)處理，與組Ⅱ相比，CF降低(P

3 討論

內(nèi)、外源性NO在缺血預(yù)適應(yīng)(ischemia preconditioning, IP)心肌保護(hù)中(包括早期、第二期)起重要作用，不僅是觸發(fā)因子，也是效應(yīng)因子[4]。機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的NO是由NOS催化非必需氨基酸左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)和O2生成的。BH4是所有NOS同功酶的輔助因子 [1-2]。內(nèi)源性NO的生成量嚴(yán)格依賴適當(dāng)?shù)腂H4水平[5]。BH4水平的減少可導(dǎo)致NOS功能失調(diào)，產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基而代替NO的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮和心肌細(xì)胞功能降低[6]。

CK絕大部分存在于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，心肌細(xì)胞以外含量甚微，是一種心肌特異性酶。所以，檢測(cè)冠脈回流液中CK的含量可以反映心肌酶漏出的程度，間接反映心肌損傷程度[7]。CF的多少則可反映冠狀動(dòng)脈的擴(kuò)張程度，從而觀察冠脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能和損傷程度。

mitoKATP被公認(rèn)為是心肌保護(hù)作用中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。mitoKATP的開(kāi)放不僅參與IP的第一窗保護(hù)作用，而且也參與第二窗保護(hù)作用，不僅能作為啟動(dòng)因子誘導(dǎo)IP，同時(shí)也是IP重要的效應(yīng)器。它的開(kāi)放能減輕MIRI [9]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示外源性BH4可提高NOS的活性，促進(jìn)內(nèi)源性NO的產(chǎn)生，發(fā)揮NO對(duì)心肌和冠狀血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，減少CK的漏出，增加CF。表明BH4能增強(qiáng)冠脈系統(tǒng)的擴(kuò)張，有利于停搏液在心肌的均勻分布和降溫，而在再灌注時(shí)則促進(jìn)有害物質(zhì)排出，減輕心肌酶的漏出，從而減輕心肌損傷，而這種保護(hù)作用也與mitoKATP的開(kāi)放有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] Fukuda Y, Teragawa H, Matsuda K, et al. Tetrahydrobiopterin restores endothelial function of coronary arteries in patients with hypercholesterolaemia. Heart, 2002,87(3):264-269.

[2] Higashi Y, Sasaki S , Nakagawa K, et al. Tetrahydrobiopterin enhances forearm vascular response to acetylcholine in both normotensive and hypertensive individuals. Am J Hypertens, 2002, 15(4):326-332.

[3] Werner ER, Antonius C.F. Gorren, Regine H, et al. Tetrahydrobiopterin and nitric oxide: Mechanistic and pharmacological aspects.Experimental Biology and Medicine, 2003, 228(11): 1291-1302.

[4] Lochnerl A, Marais E, Du Toit E, et al. Nitric Oxide Triggers Classic Ischemic Preconditioning. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2002, 962(5): 402-414.

[5] Katusic ZS. Vascular endothelial dysfunction:does tetrahydrobiopterin play a role? Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 281(3):981-986.

[6] Xia Y, Tsai AL, Berka V, et al. Superoxide generation from endothelial nitric oxide synthase: A Ca2+/calmodulin-dependent and tetrahydrobiopterin regulatory process. J Biol Chem, 1998, 273(40):25804-25808.