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篇1

【中圖分類號】R739.8 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0456-01

1 口腔鱗狀細(xì)胞癌簡介

口腔鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其好發(fā)部位依次為舌、牙齦、頰、腭、唇、口底。鱗狀細(xì)胞癌以角化珠形成及出現(xiàn)細(xì)胞間橋?yàn)椴±韺W(xué)特征。腫瘤來自表面口腔黏膜上皮，腫瘤性上皮團(tuán)或上皮島浸潤下方結(jié)締組織，細(xì)胞特征可表現(xiàn)為豐富的嗜酸性胞質(zhì)，胞核、核漿比大，程度不同的細(xì)胞及胞核的多形性，鱗狀上皮形成的角化珠和單細(xì)胞的角化均可見。OSCC占口腔頜面部癌瘤80%以上，患者5年生存率約為50%，對于腫瘤晚期和復(fù)發(fā)患者，生存率更低[1]。因此尋找有效的治療方法十分重要。經(jīng)過過去幾十年的發(fā)展，手術(shù)、放療及化療并沒有顯著提高口腔癌患者的生存率，化療藥物有明顯的副作用，而且對復(fù)發(fā)的口腔癌患者生存率的影響尚不明確。研究新的治療方法顯得尤為關(guān)鍵。

許多研究表明：惡性腫瘤的治療中，免疫治療一直走在前沿，口腔癌患者特別是鱗癌患者，其細(xì)胞免疫功能早期就不同程度地受到傷害，再加上常規(guī)治療方法（手術(shù)、放療、化療等）又可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的進(jìn)一步下降。因此，口腔癌腫的最佳治療策略應(yīng)是包括免疫治療在內(nèi)的綜合療法。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和口腔鱗癌發(fā)病功能基因的不斷探明，腫瘤基因治療這一生物治療手段越來越受到大家的認(rèn)可。自從1988年Rosenberg[2]提出要將腫瘤免疫基因治療原理實(shí)際應(yīng)用于臨床起，學(xué)者們就對腫瘤的免疫基因療法展開了深入的研究。

2腫瘤免疫基因治療的概念

廣義的腫瘤基因治療概念認(rèn)為，凡是能夠改變腫瘤細(xì)胞或其他體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能，而達(dá)到治療腫瘤目的的方法均屬于腫瘤基因治療的范疇。為區(qū)別傳統(tǒng)的化療及放療導(dǎo)致的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能（核酸）變化，將腫瘤基因治療定義為：以適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移技術(shù)將特定的外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或患者體內(nèi)，通過外源遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物或?qū)λ拗骷?xì)胞本身遺傳物質(zhì)表達(dá)的影響，直接或間接地殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞[3]。從基因操作角度看，基因治療主要有四種方法，及基因修正、基因置換、基因失活和基因修飾。近年來，免疫基因療法在腫瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用。

腫瘤免疫基因治療是依賴于機(jī)體免疫功能的間接殺傷。腫瘤免疫基因治療的定義為：根據(jù)免疫學(xué)的理論論技術(shù)建立的、以基因轉(zhuǎn)移技術(shù)為基礎(chǔ)的、以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的基因治療方法。免疫基因治療的發(fā)展反映了整個腫瘤基因治療歷史，首例得到美國FDA批準(zhǔn)的腫瘤基因治療的臨床計(jì)劃是由Rosenberg[4]提出，用細(xì)胞因子基因體外轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾TIL，最后回輸患者體內(nèi)，治療晚期惡性腫瘤病人。

3免疫基因治療的方法

基因治療在口腔鱗癌中的治療前景包括用于治療口腔鱗癌的復(fù)發(fā)和輔助治療，例如作為外科手術(shù)后的輔助措施；發(fā)生局部遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的口腔癌患者也是基因治療的應(yīng)用方向之一。盡管全身用藥理論上可以到達(dá)轉(zhuǎn)移的病灶，但是基因治療不適宜于全身輸送。因?yàn)榇蠖鄶?shù)原發(fā)和復(fù)發(fā)病灶是很表淺的，因此口腔癌患者非常適宜局部直接注射治療。目前研究的用于治療口腔鱗癌的方法包括：1）添加抑癌基因-基因添加療法；2） 去除缺陷腫瘤基因-基因去除療法；3） 減少刺激腫瘤生長的基因的表達(dá)-反義RNA；4） 增強(qiáng)免疫監(jiān)測-免疫療法；5） 前體藥物活化起到化療效應(yīng)-自殺基因療法；6） 病毒破壞腫瘤細(xì)胞的復(fù)制周期；7）呈送抗藥基因給正常組織以防止化療損傷。

4口腔癌癌基因的研究

迄今人們已在脊椎動物細(xì)胞中確定了32種與逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因同源的細(xì)胞癌基因，其中20多種與腫瘤發(fā)生有關(guān)。研究口腔癌癌基因的表達(dá)以及癌基因產(chǎn)物的形成，對從分子水平認(rèn)識口腔癌的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為具有重要意義。Hoellering[5]等采用生物素化的H-ras，cDNA探針原位雜交技術(shù)和免疫組化技術(shù)，對5例口腔癌患者腫瘤組織中H-ras癌基因的mRNA及其產(chǎn)物P2蛋白進(jìn)行定位研究，發(fā)現(xiàn)H-ras癌基因與mRNA的分布可能與口腔癌的生長方式及預(yù)后有關(guān)。且發(fā)現(xiàn)晚期口腔癌組織中均有ras和myc家族癌基因的擴(kuò)增。在口腔鱗癌中，c-myc表達(dá)量較正常組高2～5倍，平均水平為0.34±0.16pg /μg，其它與口腔腫瘤有關(guān)的癌基因還有c-erb-B2、fes、mos、myb等，其中ab1基因在口腔上皮癌細(xì)胞株的表達(dá)與其脫壁生長特征有關(guān)。進(jìn)一步研究口腔腫瘤中癌基因的各種變化，無疑對揭示口腔腫瘤的發(fā)生機(jī)制和指導(dǎo)免疫基因治療具有重要意義。

5 口腔鱗癌的免疫基因療法

免疫基因療法治療口腔癌有兩種途徑：一是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的致免性，一是提高患者對腫瘤的免疫反應(yīng)性。研究表明頭頸部鱗癌患者有數(shù)種免疫細(xì)胞功能缺陷，包括自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、以及一些細(xì)胞因子。盡管口腔癌沒有經(jīng)典的免疫性，但是很多證據(jù)表明其具有免疫識別功能。已進(jìn)行的動物研究包括給予IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生LAK細(xì)胞、TNF- A，將 IL- 2、IL- 4、IFN- C、IL-6或IL-1B轉(zhuǎn)入腫瘤起到免疫調(diào)節(jié)作用聯(lián)合應(yīng)用非病毒脂質(zhì)體表達(dá)的鼠白介素 2和多聚體表達(dá)的mIL- 12治療口腔鱗癌，試驗(yàn)證明是可行并有效的[6]。mIL-2和mIL-12聯(lián)合運(yùn)用產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效應(yīng)可能是由于其刺激增強(qiáng)了Tc細(xì)胞和NK的活性。此外，最新研究表明，應(yīng)用缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠?qū)NF-α基因?qū)肟谇击[癌DNL中，帶有TNF-α基因的DNL能夠分泌高活性的TNF-α，表明口腔鱗癌DNL可作為基因轉(zhuǎn)移的運(yùn)載細(xì)胞用于口腔鱗癌的細(xì)胞因子基因治療。

5.1 細(xì)胞因子與免疫基因治療

在當(dāng)前所開展的基因治療研究中，免疫基因治療的研究多集中于細(xì)胞因子基因治療的研究。細(xì)胞因子的基因治療避免了以往細(xì)胞因子注射療法需反復(fù)多次給患者或動物模型注射大劑量細(xì)胞因子所帶來的不良反應(yīng)，也取得了細(xì)胞因子注射療法所不具備的治療效果。細(xì)胞因子基因治療所選用的目的基因是可以編碼表達(dá)包括ILs、IFNs、CSFs及TNFs等在內(nèi)的各種細(xì)胞因子及其受體的基因[7]。依據(jù)將細(xì)胞因子基因?qū)塍w內(nèi)的途徑和原理不同，細(xì)胞因子基因治療可分為以下幾類：（1）以免疫效應(yīng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（2）以瘤苗為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（3）以抗原呈遞細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（4）成纖維細(xì)胞等受體細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療；（5）直接體內(nèi)注射途徑的細(xì)胞因子基因治療。

5.2 抗體與免疫基因治療[8]

（1）抗體增強(qiáng)免疫基因治療的靶向性：解決免疫效應(yīng)細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞的特異性是腫瘤治療的關(guān)鍵之一，研究表明將腫瘤特異性單鏈抗體基因?qū)隩細(xì)胞中，使之分泌抗體，一方面通過抗體殺傷腫瘤細(xì)胞；另一方面通過抗體使特異性結(jié)合增加。

（2）抗體作為免疫基因治療的效應(yīng)分子：胞內(nèi)抗體可用于腫瘤治療。美國學(xué)者構(gòu)建了一種編碼單鏈抗體的載體（PGT21），將此載體轉(zhuǎn)入高表達(dá)erbB2的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞中，可以通過胞內(nèi)表達(dá)抗體erbB2單鏈抗體，抑制瘤細(xì)胞的生長。

（3）抗原與免疫基因治療：在腫瘤治療方面，經(jīng)FDA批準(zhǔn)，已有學(xué)者將編碼CEA、Ig基因表達(dá)載體直接導(dǎo)入結(jié)腸癌和口腔鱗癌患者體內(nèi)，臨床顯示其有一定抗腫瘤效應(yīng)。

5.3 綜合性免疫基因治療

有研究表明，單一途徑的免疫基因治療效果并不理想，因此，將相互間有相加或協(xié)同效應(yīng)的不同方法聯(lián)合起來治療口腔鱗癌的臨床效應(yīng)值得嘗試。目前主要的研究方向有：細(xì)胞因子基因治療與細(xì)胞因子基因治療的聯(lián)合；細(xì)胞因子基因治療與B7等共刺激分子基因治療聯(lián)合；細(xì)胞因子基因治療與MHC基因治療聯(lián)合；④細(xì)胞因子基因治療與抗原基因治療聯(lián)合；⑤細(xì)胞因子基因治療與自殺基因聯(lián)合治療。

6展望

綜上所述，口腔頜面鱗癌免疫基因療法發(fā)展至今，經(jīng)歷了從單一途徑療法轉(zhuǎn)向多途徑聯(lián)合治療的階段，進(jìn)一步提高了臨床療效。伴隨著新的免疫基因療法的不斷問世，基因聯(lián)合療法的治療效果更加明顯，且不良反應(yīng)也大大降低。同時，結(jié)合口腔鱗癌術(shù)前術(shù)后輔助療法是可行的治療方式，并有望進(jìn)一步提高生存率。比較同期不同心的聯(lián)合基因療法的隨機(jī)試驗(yàn)仍在進(jìn)行中，這些試驗(yàn)將可能為治療口腔頜面部鱗癌患者治療中的作用確立1個新的位置。另外口腔鱗癌往往伴有第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險，已經(jīng)成為影響患者長期生存率的重要因素之一。免疫基因療法對于第二原發(fā)腫瘤的影響如何，有待進(jìn)一步研究。

免疫基因治療是一種新興的治療腫瘤的方法。隨著腫瘤分子生物化學(xué)研究的不斷深入，我們能夠拓展基因治療腫瘤的方法，選擇性針對腫瘤細(xì)胞。由于口腔鱗癌基因突變頻繁，位置表淺易于瘤內(nèi)給藥，因此基因治療適合運(yùn)用于口腔鱗癌。基因療法用于Ⅰ期的頭頸部鱗癌是安全有效的；對于Ⅱ期鱗癌，聯(lián)合放療或化療，也能起到抗瘤效應(yīng)；作為輔助措施治療Ⅲ期鱗癌的正在進(jìn)一步研究中。以后的研究方向在于建立起安全有效的利用免疫基因療法治療口腔鱗癌的方法體系。

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篇2

肺癌是常見的惡性腫瘤之一,目前治療是以手術(shù)、化療、放療為主,聯(lián)合生物治療、中醫(yī)中藥治療等的綜合治療模式,但隨著腫瘤分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肺癌生物治療不斷被賦予新的內(nèi)容,治療方法逐漸擴(kuò)展到基因治療、免疫治療以及近年來興起的分子靶向治療[1],為肺癌治療開辟了更為廣闊的前景。本文就肺癌生物治療的現(xiàn)狀及研究進(jìn)展綜述如下。

1 肺癌生物治療現(xiàn)狀

生物治療的原理是通過為腫瘤患者補(bǔ)充具有殺死、抑制腫瘤能力的免疫細(xì)胞和能力,調(diào)節(jié)患者自身免疫功能,達(dá)到控制和清除腫瘤細(xì)胞的目的,主要包括細(xì)胞因子技術(shù)、基因治療技術(shù)、腫瘤疫苗技術(shù)、免疫活性細(xì)胞繼承性輸注技術(shù)、單克隆抗體及其耦聯(lián)物技術(shù)等[2],彼此之間并沒有明確的界限,它們的出現(xiàn)標(biāo)志著腫瘤生物治療體系的基本形成,雖然途徑與方法各異,但目的都是通過最大限度的利用人體自身所具有的抗腫瘤能力來治療惡性腫瘤。生物治療有自己獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),毒副反應(yīng)較低.僅在高劑量時有低血壓、發(fā)熱皮疹、抗原抗體反應(yīng)等,發(fā)生率較低[3],臨床上治療肺癌應(yīng)用最多的為細(xì)胞因子,免疫調(diào)節(jié)劑、基因治療和分子靶向治療藥物也已應(yīng)用于臨床,過繼免疫細(xì)胞中淋巴活化殺傷細(xì)胞(LAK)已見報告,為今后生物治療的發(fā)展研究提供了豐富的內(nèi)容。

2 肺癌生物治療研究進(jìn)展

2.1 分子靶向治療腫瘤分子靶向治療是利用分子靶向藥物特異性,以腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中所具有的特異性分子為靶點(diǎn),阻斷該靶點(diǎn)的生物學(xué)功能,或選擇性從分子水平來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,從而達(dá)到抑制腫瘤生長甚至腫瘤消退的目的[4]。其中以表皮生長因子受體(EGFR)和腫瘤血管生成作為靶點(diǎn)的藥物占60%,以表皮生長因子受體作為靶點(diǎn)的治療藥物包括吉非替尼、埃羅替尼、西妥昔單抗等,以腫瘤血管生成作為靶點(diǎn)的治療藥物包括貝伐單抗、ZD647、內(nèi)皮抑素、基質(zhì)金屬蛋白酶等,其它靶向治療藥物如基質(zhì)金屬蛋白激酶(MMPs)抑制劑、血管生成因子抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)化酶抑制劑(FTIs)、環(huán)氧化酶抑制劑、組氨酸脫乙?；敢种苿┑确肿影邢蛐运幬镎谶M(jìn)行臨床前或臨床試驗(yàn)研究中[5]。

2.2 細(xì)胞因子治療 常用于肺癌的細(xì)胞因子有干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)和集落刺激因子(CSF)等。細(xì)胞因子的應(yīng)用是目前最成熟的生物治療方法,尤其是IFN和IL,目前已經(jīng)在肺癌治療中應(yīng)用非常成熟,CSF、TNF、EPO等也逐漸被廣泛應(yīng)用,在腫瘤的治療中起到了重要作用。IFN是最早發(fā)現(xiàn)具有抗癌效應(yīng)的細(xì)胞因子,早在1980年第一次用于小細(xì)胞肺癌(SCLC)的實(shí)驗(yàn)中就顯示出了良好的前景。IL一24是近來發(fā)現(xiàn)的一種新白介素,利用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法發(fā)現(xiàn)其可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖并可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對放療的敏感性。CSF及EPO的應(yīng)用對于克服骨髓抑制、預(yù)防傳統(tǒng)放化療所產(chǎn)生的白細(xì)胞下降及紅細(xì)胞減少無疑起到了保駕護(hù)航的作用,為提高放化療藥物的使用劑量從而達(dá)到更好的治療效果起到了關(guān)鍵作用[6]。

2.3 免疫治療 主要包括腫瘤疫苗、過繼性免疫治療及補(bǔ)充細(xì)胞因子,其中發(fā)展最快的是腫瘤疫苗。目前應(yīng)用的肺癌疫苗有腫瘤細(xì)胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因產(chǎn)物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗獨(dú)特型疫苗和樹突狀細(xì)胞疫苗等,樹突狀細(xì)胞疫苗能形成強(qiáng)有力的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,有效地清除血源性播散的肺癌細(xì)胞,發(fā)展最為矚目[7],Ueda等應(yīng)用CEA652體外沖擊致敏樹突細(xì)胞,治療CEA陽性的肺腺癌患者,發(fā)現(xiàn)治療后患者病情穩(wěn)定,血清中CEA水平明顯降低。受到重視的還有第3代疫苗:核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗, DNA疫苗在體內(nèi)可持續(xù)高表達(dá)相應(yīng)抗原,被樹突細(xì)胞攝取并致敏后,激發(fā)高效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),是最有潛力的腫瘤疫苗發(fā)展方向。

2.4 基因治療

2.4.1p53基因治療 在基因治療研究中,以腺病毒轉(zhuǎn)染抑癌基因p53的表達(dá)研究較為成功。國外對重組腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療NSCLC的臨床研究已基本完成,結(jié)果顯示腺病毒p53注射液在NSCLC中有抗瘤活性。一項(xiàng)研究中,對12例氣道阻塞且無法手術(shù)的肺癌患者瘤內(nèi)注射重組腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重復(fù)一次,其中6例患者癥狀得到緩解。然而也有研究者將重組腺病毒p53注射液聯(lián)合化療治療NSClC,發(fā)現(xiàn)兩組療效和生存期無顯著差異。

2.4.2 殺傷基因?qū)⒕哂袣饔玫幕蚱螌?dǎo)入細(xì)胞復(fù)制的DNA序列中,從而打斷細(xì)胞基因的連續(xù)性,抑制基因的過量表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的增殖。自殺基因和凋亡基因通過引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡而起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。TK基因-GCV系統(tǒng)是最有希望在臨床上用于腫瘤基因治療的方法之一,在肺癌基因治療中具有顯著作用。

2.4.3 RNAi技術(shù) 在針對腫瘤的基因治療策略中,RNAi技術(shù)以其自身的諸多優(yōu)勢,在不影響正?；蚬δ艿那疤嵯?可以針對在細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、血管生成因子及其受體以及部分關(guān)鍵酶等,抑制突變基因表達(dá)或基因的過量表達(dá)。如Zhang等用HER-1 siRNA抑制了肺癌細(xì)胞A549的EGFR的表達(dá),使肺癌細(xì)胞比對照組細(xì)胞數(shù)減少了85%,EGFR蛋白表達(dá)下降了70%以上,對順鉑的敏感性增加了4倍。

3 展望

作為一種新的治療模式,生物治療目前還存在很多問題,如各種治療藥物的有效性、安全性還有待于進(jìn)一步評價,是否有必要采用特異性檢測手段篩選分子靶向藥物的適應(yīng)人群來實(shí)現(xiàn)個體化用藥,及建立這類藥物與手術(shù)、放化療之間的最佳聯(lián)合方案還需不斷摸索。但我們深信在不久的將來,隨著對腫瘤生物學(xué)特性和行為了解的不斷加深、分子藥物研究的不斷發(fā)展,將會出現(xiàn)一批新型的低毒、高效靶向治療藥物,為肺癌乃至其他所有腫瘤患者帶來福音。

參考文獻(xiàn)

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篇3

Abstract

AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.

METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.

RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P

CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.

KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV

自殺基因治療是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，也是目前最有可能有效應(yīng)用于臨床的腫瘤基因治療策略之一。構(gòu)建安全高效的載體是基因治療的關(guān)鍵。我們已經(jīng)成功的構(gòu)建了含有hTERT啟動子的腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK[1]。我們將探討該載體對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞在體外的作用。

1材料和方法

1.1材料

Y79細(xì)胞株[美國模式菌種收集中心(ATCC)];RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL試劑盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);雙丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白質(zhì)Marker(上海生化試劑公司);實(shí)驗(yàn)所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。

1.2方法

將經(jīng)過證實(shí)的含有pcChCDTK質(zhì)粒的JM109菌液0.2mL接種到200mL含50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，280r/min的搖床上培養(yǎng)16h，將菌液轉(zhuǎn)移到離心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步驟進(jìn)行操作提取質(zhì)粒pcChCDTK，干燥后，加無菌水溶解質(zhì)粒300μL，用Duc 640分光光度計(jì)測定DNA含量，20℃分裝保存。用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)Y79細(xì)胞，每日在倒置相差顯微鏡下觀察。Y79細(xì)胞懸浮生長，培養(yǎng)中細(xì)胞可聚集成團(tuán)并沉集于培養(yǎng)瓶底部，當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿瓶底即可傳代，按照1∶2～1∶4傳代。將傳代后的Y79細(xì)胞培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，即可用于電轉(zhuǎn)化。未轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞生長迅速，傳代后培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期。取上述進(jìn)入對數(shù)生長期并基本鋪滿瓶底的細(xì)胞，在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細(xì)胞。用0.01mol/L PBS 10mL重懸細(xì)胞，取細(xì)胞懸液20μL，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，其余細(xì)胞在22℃，1000r/min條件下，離心10min，重新收集細(xì)胞;根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重懸細(xì)胞。取800μL細(xì)胞重懸液加入到含有pcChCDTK質(zhì)粒20μg的EP中，吹打混勻，然后轉(zhuǎn)入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進(jìn)行電擊。電擊后，迅速將電擊產(chǎn)物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的75cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃，50mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)染后的Y79細(xì)胞生長與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相似。倒置相差顯微鏡下見細(xì)胞懸浮生長，形狀飽滿，色澤鮮亮，聚集成團(tuán)。

1.2.1 CDTK基因表達(dá)的檢測

提取Y79細(xì)胞RNA;參照reverse transcription system kit進(jìn)行RTPCR反應(yīng);取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL作為模板，以yCDrt和TKrt為引物擴(kuò)增CDTK，同時用βactin擴(kuò)增引物作對照，RTPCR產(chǎn)物用8g/L瓊脂糖凝膠跑膠檢測。另取未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞設(shè)為對照，同法處理。取轉(zhuǎn)染48h和未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞預(yù)處理;固定玻片;配制分離膠和堆積膠;上樣;跑膠;轉(zhuǎn)膜;封閉;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;顯色;曝光。

1.2.2 5FU濃度的檢測

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液在37℃，50mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK前24h換液，調(diào)整細(xì)胞密度使之在轉(zhuǎn)染時達(dá)基本鋪滿瓶底。將細(xì)胞在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細(xì)胞，用適當(dāng)體積的無血清的RPMl1640培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，使之密度為6.25×109/L。取細(xì)胞懸液800μL加入自殺基因載體pcChCDTK 20μg，將其混勻，轉(zhuǎn)入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進(jìn)行電擊。電擊后，細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24h后收集細(xì)胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，以每孔2×105個細(xì)胞的濃度植入24孔板，每孔培養(yǎng)液體積1mL。24h后加入前體藥物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其細(xì)胞上清，用高效液相色譜儀(HPLC)檢測其5FU的濃度。配5FC及5FU標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。LC10A高效液相色譜儀;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);預(yù)柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流動相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;檢測波長266nm;柱溫37℃。10μL進(jìn)樣。

1.2.3前體藥物對細(xì)胞毒性的檢測

采用Western Blot技術(shù)檢測新融合自殺基因CDTK在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平表達(dá)。人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液在37℃，50mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。以2×105個細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)，每孔體積200μL。24h后，加入不同濃度的前體藥物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每個濃度梯度有4孔。留1孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液做空白對照孔。在37℃，50mL/L CO2的條件下，細(xì)胞不換液培養(yǎng)5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)上清液。每孔加入DMSO 150μL，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上調(diào)定各孔吸收值。以每天進(jìn)行換液的細(xì)胞做對照，假設(shè)細(xì)胞存活率為100%，將其它各細(xì)胞孔的吸收值與其比較得出各處理組細(xì)胞的平均存活率。另視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24h換液，調(diào)整細(xì)胞密度使之在轉(zhuǎn)染時達(dá)基本鋪滿培養(yǎng)瓶底。將pcChCDTK載體電轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞。電擊后，細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24h后，收集細(xì)胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，以每孔2×105個的密度植入96孔板中培養(yǎng)，每孔體積200μL。24h后加入不同濃度的前體藥物100μL，5FC+GCV以兩藥的對應(yīng)濃度加入96孔板，每個濃度梯度有4孔。留一孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液做空白對照孔。然后用MTT法檢測細(xì)胞存活率。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所得數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用StudentNeuman Keuls(SNK)檢驗(yàn)，以P

2結(jié)果

2.1 Y79細(xì)胞轉(zhuǎn)染后CDTK基因的表達(dá)

RTPCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組可見一403bp特異條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。而在未轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞中，未擴(kuò)增出403bp特異條帶。在兩組中均擴(kuò)增出作為內(nèi)對照的βactin產(chǎn)物561bp條帶。分析結(jié)果顯示：大小為42kD的內(nèi)參βactin蛋白條帶在轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞中均可見，一個大小為59kD的條帶，在轉(zhuǎn)染了pcChCDTK載體的Y79細(xì)胞中可見，這與yCDTK基因序列分析的預(yù)期蛋白大小一致，為自殺基因yCDTK蛋白。未轉(zhuǎn)染pcChCDTK的Y79細(xì)胞中則沒有59kD的條帶出現(xiàn)(圖2)。

2.2 Y79細(xì)胞轉(zhuǎn)染后5

FC轉(zhuǎn)化效率 加5FC 24h后上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，5FC向5FU的轉(zhuǎn)化效率約為84.5%。

2.3前體藥物對Y79細(xì)胞的毒性

將生長良好的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞，按每孔2×105個細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)。加入不同濃度的前體藥物5FC培養(yǎng)5d，平均細(xì)胞存活率分別為98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK檢驗(yàn)表明，各梯度間的細(xì)胞存活率存在顯著性差異(P

2.4前體藥物對用腫瘤殺傷載體轉(zhuǎn)染的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性檢測

將電轉(zhuǎn)了pcChCDTK的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞，按相同的密度將細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)。加入不同濃度的前體藥物5FC培養(yǎng)5d，平均細(xì)胞存活率分別為94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK檢驗(yàn)表明，各梯度間的細(xì)胞存活率存在顯著性差異(P

3討論

目前，相對于傳統(tǒng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)治療方法而言，RB基因治療不僅可以彌補(bǔ)光凝固治療、光動力學(xué)治療、溫?zé)嶂委?、冷凍治療的?yīng)用局限性，而且不會產(chǎn)生諸如化學(xué)治療、放射治療的副作用，更不會因?yàn)檠矍蛘鶎?dǎo)致的致殘性而造成患兒心理障礙影響生圖1RTPCR產(chǎn)物凝膠電泳圖 M:DL2000 Marker;1:轉(zhuǎn)染組可見預(yù)期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未轉(zhuǎn)染組;3:陰性對照。圖2Western Blot檢測CDTK的表達(dá) A：1，2:βactin(42kD);B：1:轉(zhuǎn)染pcChCDTK的Y79細(xì)胞，出現(xiàn)一條約59kD蛋白;2:未轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞。

存質(zhì)量。因此，RB基因治療的研究越來越為人們所重視，并且通過不同的治療策略取得了一系列的研究進(jìn)展?，F(xiàn)階段對RB基因治療的研究主要集中在4種不同的基因上，包括自殺基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB發(fā)生的分子機(jī)制還不是太清楚，而且與RB形成相關(guān)的抑癌基因凋亡誘導(dǎo)基因種類繁多，與腫瘤血管形成相關(guān)的誘導(dǎo)因子和抑制因子多種多樣，且分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。我們選擇雙自殺基因CDTK作為目的基因，實(shí)施RB的自殺基因治療。首先，自殺基因作為腫瘤基因治療的候選基因，已經(jīng)在多種腫瘤開展研究[27]。其表達(dá)產(chǎn)物和前體藥物相互作用來實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療的機(jī)制比較清楚。其次，自殺基因和前體藥物相互作用產(chǎn)生的毒性物質(zhì)能通過不同方式實(shí)現(xiàn)對鄰近腫瘤細(xì)胞的旁殺效應(yīng)，包括直接分泌到細(xì)胞外旁殺，或通過細(xì)胞間隙連接旁殺，或通過產(chǎn)生凋亡小體、免疫介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)旁殺。同時，目前的研究表明，自殺基因系統(tǒng)治療RB是安全有效的[8]。我們設(shè)計(jì)的含有雙自殺基因CDTK的載體通過電轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79細(xì)胞。48h后，提取轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞RNA，RTPCR的結(jié)果可見一403bp特異條帶，與預(yù)期大小一致，顯示雙自殺基因CDTK在細(xì)胞中mRNA水平得到了表達(dá)。Western blot的結(jié)果也同樣顯示，載體轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞中，59kD的目的基因蛋白有明顯的表達(dá)。這兩個實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明，我們構(gòu)建的雙自殺基因CDTK在靶細(xì)胞Y79中得到表達(dá)。先前的研究顯示，被設(shè)計(jì)得的融合基因yCD/UPRT、大腸桿菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最強(qiáng)的催化前體藥物向細(xì)胞毒物轉(zhuǎn)化的能力。我們通過HPLC檢測5FU的濃度，上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，故5FC向5FU的轉(zhuǎn)化效率約為84.5%，說明我們所構(gòu)建的腫瘤特異性雙自殺基因載體具有很強(qiáng)的催化前體藥物向細(xì)胞毒性物質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。

雙自殺基因療法是將兩種自殺基因整合在一起，通過載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的融合基因產(chǎn)物具備兩種酶的活性。因此，雙自殺基因療法可以大大提高抑制腫瘤生長的功效，同時使得前體藥物的用量減半。大量資料表明雙前體藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用要強(qiáng)于單前體藥物。但也有資料顯示雙自殺基因之間可能存在拮抗效應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)加5FC的細(xì)胞殺傷最強(qiáng)，要高于5FC和GCV都加的組，而單獨(dú)加GCV的細(xì)胞殺傷力最低， CD和TK之間沒有協(xié)同作用，反而可能會相互干擾各自功能的運(yùn)行。原因可能有兩個方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同時加5FC和GCV時，CD/5FC和TK/GCV兩種系統(tǒng)的功能出現(xiàn)拮抗效應(yīng);(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某種原因，CD和TK的活性在這個融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV兩種系統(tǒng)的抑瘤能力同時或其中一種得到增強(qiáng)。當(dāng)E.coli CD和HSV1 TK基因同時在一種細(xì)胞中表達(dá)時，會存在相互干擾作用。這種干擾作用的機(jī)制到目前還沒搞清楚，但干擾作用可能不是發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄期，而是在轉(zhuǎn)錄之后，TK介導(dǎo)的5FUMP的磷酸化會產(chǎn)生無毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性產(chǎn)物5FUDP和5FUTP，從而減低了CD/5FC的細(xì)胞毒性作用;或者CD介導(dǎo)的對GCV，ACV等的脫胺反應(yīng)減低了TK/GCV系統(tǒng)的細(xì)胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性與單獨(dú)的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于單獨(dú)CD酶活性100倍。這種酶活性的改變可能與這3種酶的蛋白質(zhì)特性不同有關(guān)。加入不同濃度的前體藥物5FC，GCV或5FC+GCV于電轉(zhuǎn)了pcChCDTK的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞培養(yǎng)5d， SNK檢驗(yàn)表明，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對應(yīng)濃度組比較，當(dāng)5FC濃度達(dá)到100mg/L后各對應(yīng)濃度平均細(xì)胞存活率組間均存在差異(PGCV >5FC。在本實(shí)驗(yàn)中，單前體藥物對雙自殺基因CDTK載體轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞均有殺傷作用，但雙前體藥物的殺傷作用要強(qiáng)于單前體藥物。分析產(chǎn)生這種結(jié)果的原因，我們認(rèn)為：(1)雙自殺基因載體具有很強(qiáng)的催化前體藥物向細(xì)胞毒物轉(zhuǎn)化的能力;(2)這可能與我們加入的CMV增強(qiáng)子能大大促進(jìn)hTERT啟動子啟動下游目的基因的表達(dá)有關(guān)，因?yàn)镃MV增強(qiáng)子具有強(qiáng)大的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄能力，且沒有組織特異性。

參考文獻(xiàn)

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篇4

【關(guān)鍵詞】 肝癌；腺病毒； p53；基因治療

〔Abstract〕 Objective To explore the potential use of adenovirus mediated p53 gene (Ad-p53) therapy for hepatocellular carcinoma.

Methods A human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was used. Recombinant adenovirus carrying wild-type p53 gene was transfected into HepG2 cells in vitro and injected into tumor nodules in vivo. The growth of HepG2 cells in vitro and established hepatocellular carcinoma nodules in nude mice was examined. Cell apoptosis was analysed by Annexin-V/PI labeling flow cytometry method.

Results

Cell growth was greatly suppressed at ≥ 125MOI. p53 transfection can increase HepG2 cells apoposis rate. In vivo studies， intratumoral injection of Ad-p53 significantly inhibited hepatocellular carcinoma implanted xenograft.

Conclusion

Transfection of wild-type p53 gene via Ad-p53 is a potential approach to the therapy of hepatocellular carcinoma.

〔Key Words〕

Kepatocellular carcinoma; Adenovirus; p53; Gene therapy

原發(fā)肝細(xì)胞性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，因其惡性程度高、預(yù)后差，目前臨床采用的多種傳統(tǒng)治療手段都不能收到滿意的效果。p53 基因在肝癌細(xì)胞中的突變率達(dá) 50% 以上[1]，是肝癌細(xì)胞中突變頻率最高的基因，因此成為肝癌基因治療的最佳靶點(diǎn)之一。腺病毒 DNA 不整合到宿主細(xì)胞基因組中，對人體無遺傳毒性，作為基因載體既可感染處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞，也可感染靜息期細(xì)胞。本研究旨在探討重組人 p53 腺病毒（Ad-p53）對人肝癌 HepG2 細(xì)胞的抑制作用，現(xiàn)報道如下。

1

材料與方法

1.1

材料

重組腺病毒介導(dǎo) p53 基因（Ad-p53）由深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司提供，對照病毒 Ad-LacZ 由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院伍莊博士惠贈。人肝癌細(xì)胞株 HepG2（內(nèi)源性表達(dá)野生型 p53）由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院伍莊博士惠贈，細(xì)胞在 RPMI-1640 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。5~7 周齡 BALB/c 裸鼠，雌性，體重 18~21 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于無菌塑料透明隔離器內(nèi)，動物實(shí)驗(yàn)時嚴(yán)格無菌操作。

1.2

MTT 法檢測病毒感染滴度與細(xì)胞存活的關(guān)系

將 HepG2 細(xì)胞按每孔 500 個細(xì)胞分別接種于 96 孔板內(nèi)，第 2 天用 Ad-p53 分別以 10、25、50、75、100、125、150 效靶比（multiplicity of infection， MOI）感染細(xì)胞，對照組不加藥，每一 MOI 值重復(fù) 6 孔。37℃，5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10 h 后棄去病毒感染液，換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定光吸收度。

1.3

MTT 法檢測病毒感染時間與細(xì)胞存活的關(guān)系

將 HepG2 細(xì)胞按每孔 500 個細(xì)胞分別接種于 96 孔板內(nèi)，第 2 天用 Ad-p53 以 125 MOI 感染細(xì)胞，對照組不加藥，每一時間值重復(fù) 6 孔。37℃，5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 30、60、90、120、150 min 后棄去病毒感染液，換新鮮培養(yǎng)液，24 h 后換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后 DMSO 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定光吸收度。

1.4

臺盼藍(lán)染色繪制細(xì)胞生長曲線

將 HepG2 細(xì)胞 1×105 接種于 60 mm 的平皿，培養(yǎng)到約 70% 匯合，細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸出培養(yǎng)液，125 MOI 值的 Ad-p53 和空載體腺病毒 Ad-LacZ 感染 HepG2 細(xì)胞，設(shè)空白對照，每天觀察細(xì)胞生長狀況，于感染的 2、4、6、8 d，用 2.5 g/L 胰蛋酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每皿重復(fù) 3 次，取平均值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5

Annexin V/PI 雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

分別取 5×105 個對數(shù)生長期 HepG2 接種于 6 孔板， 125 MOI 值的 Ad-p53、Ad-LacZ 及 PBS 作用 24 h 后收獲細(xì)胞，每個標(biāo)本加入 Annexin V 2 L、PI 熒光抗體 2 L，室溫避光雙染色 15 min，加入 400 L 結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測分析，獲得標(biāo)記陽性的細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6

Ad-p53 對裸鼠移植瘤生長的抑制作用

HepG2 細(xì)胞在 37℃，5% CO2，含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用 0.25% 胰蛋白酶消化，用無菌 PBS 液重懸制成 5×107/mL 的單細(xì)胞懸液，每只裸小鼠于右側(cè)后肢外側(cè)皮下接種 0.2 mL (1×107)細(xì)胞懸液，共 18 只。接種 6 d 后，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為 3 組，每組 6 只，于腫瘤結(jié)節(jié)（或腫瘤接種部位）內(nèi)分別注射 0.1 mL 的 PBS 液或含有 5×107 pfu 的 Ad-LacZ、Ad-p53。每隔 3 d 注射 1 次，共注射 5 次，每次注射前測量腫瘤體積。游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的長度（a）和寬度（b），按公式 V=ab2/2 計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。

1.7

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 x±s 表示，采用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對 t 檢驗(yàn)。

2

結(jié)

果

2.1

病毒感染滴度與細(xì)胞存活的關(guān)系

與空白對照相比，Ad-p53 對 HepG2 細(xì)胞有明顯抑制作用，隨著 MOI 的增加，野生型 p53（wild type- p53，wt-p53）對細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)病毒量為 125 MOI 時，HepG2 細(xì)胞基本達(dá)到完全抑制（圖 1）。

2.2

MTT 法檢測病毒感染時間與細(xì)胞存活的關(guān)系

Ad-p53 對 HepG2 細(xì)胞的抑制作用與病毒感染時間有關(guān)，隨著感染時間的延長，wt-p53 對細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)感染時間達(dá)到 120 min 時，HepG2 細(xì)胞基本達(dá)到完全抑制（圖 2）。

2. 3

Ad-p53 對肝癌細(xì)胞生長抑制的檢測

125 MOI 值的空載體腺病毒 Ad2LacZ 對 HepG2 細(xì)胞的生長影響與對照組相比沒有差別，而以 125 MOI 值的 Ad-p53 感染 HepG2 細(xì)胞能對細(xì)胞生長產(chǎn)生明顯抑制（P < 0.01，圖 3）。這一結(jié)果表明，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用來自轉(zhuǎn)導(dǎo)的野生型 p53cDNA，而不是缺陷腺病毒載體本身。

2.4

Annexin V/PI 雙染色法檢測細(xì)胞早期凋亡

125 MOI 值的 Ad-p53、Ad-LacZ 及 PBS 作用于 HepG2 細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞早期凋亡率（Annexin V+/PI-）和細(xì)胞總凋亡率（Annexin V+/PI-與 Annexin V+/PI+之和）結(jié)果見表 1。

2.5

Ad-p53 對裸鼠移植瘤生長的抑制作用

所有 18 只裸鼠均成活，3 組裸鼠給藥前體重和腫瘤體積經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間均無顯著性差異（P > 0.05），表明各組裸鼠體重和腫瘤體積在治療前均衡性好。在細(xì)胞懸液接種后的第 6 天，各個接種點(diǎn)均可見實(shí)體腫瘤結(jié)節(jié)，直徑 0.4~0.6 cm。裸鼠荷瘤瘤體內(nèi)注射PBS 和 Ad-LacZ 后，體積仍持續(xù)增大；相反，注射Ad-p53 后腫瘤的生長即受到十分明顯的抑制（圖 4）。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，與 PBS 注射組相比，Ad-LacZ 組腫瘤體積并未見顯著降低（P > 0.05），而 Ad-p53 組的腫瘤生長幅度均受到明顯的抑制，平均體積較PBS 組（P < 0.01）和 Ad-LacZ 組（P < 0.01）顯著降低。

轉(zhuǎn)貼于

3

討

論

p53 基因是正常細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的看家基因，是最重要的一個抑癌基因。其通過以下作用實(shí)現(xiàn)抑癌作用：①細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)損傷細(xì)胞修復(fù)[2]；②誘導(dǎo)嚴(yán)重受損細(xì)胞凋亡[3]；③調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)；④抑制生存增殖信號途徑[4]；⑤ 抑制血管生成及物質(zhì)能量代謝；⑥ 抑制細(xì)胞-細(xì)胞黏附及其浸潤轉(zhuǎn)移。p53 基因異常而失去上述抗細(xì)胞增殖、促凋亡功能時細(xì)胞極易發(fā)生異常增生和癌變?？梢?DNA 損傷的放射線、化學(xué)劑和熱，都產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡，正常功能的野生型 p53 基因即促進(jìn)這些效應(yīng)，p53 基因缺失或變異即減弱甚至破壞了這些效應(yīng)。人類腫瘤的 50% 以上都存在 p53 變異而功能失常，從而降低了治療的療效。抑癌基因治療是將正常的腫瘤抑制基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可代替和補(bǔ)償缺陷的基因，以抑制腫瘤的生長，這是從根本攻克腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。p53 基因是與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，是腫瘤基因治療的重要靶點(diǎn)之一，通過導(dǎo)入野生型 p53 來重建細(xì)胞內(nèi)變異的 p53 已成為腫瘤治療的新策略，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，野生型p53 的導(dǎo)入對多類腫瘤產(chǎn)生明顯的抑制作用[5-7]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到以腺病毒為載體的 wt-p53 導(dǎo)入對肝癌細(xì)胞生長產(chǎn)生明顯抑制。發(fā)現(xiàn) Ad-p53 的抑制作用與感染濃度及感染時間有關(guān)，隨著感染濃度的增高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng) Ad-p53 對癌細(xì)胞在感染濃度 100 MOI 時能基本達(dá)到完全抑制。Ad-p53 感染時間越長，抑制作用越明顯，當(dāng)感染時間達(dá)到 120 min 時，HepG2 細(xì)胞基本達(dá)到完全抑制。通過與重組腺病毒 Ad-LacZ 對照，表明此抑制作用來自野生型p53 基因的表達(dá)，而不是重組腺病毒本身。在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們觀察了 Ad-p53 對荷瘤裸鼠腫瘤生長的作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng) Ad-p53 注射的腫瘤結(jié)節(jié)生長受到了明顯的抑制，Ad-p53 實(shí)體瘤局部注射是可取的治療方案。國內(nèi)外在肺癌、頭頸部癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤的Ⅰ或Ⅱ期臨床試驗(yàn)已初步證明[7-10]，它不僅對一些腫瘤有治療效果，而且未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒副作用。

本研究結(jié)果證實(shí)：無論用細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染還是種植瘤內(nèi)注射的方法，都顯示了 Ad-p53 對肝癌細(xì)胞的抑制作用，為臨床應(yīng)用 p53 基因治療肝癌提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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〔3〕 Balint E， Vousden KH. Activation and activities of the p53 tumor suppressor protein〔J〕. Br Cancer， 2002， 85:1813-1823

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〔6〕 Sun HW， Tang QB， Cheng YJ， et al. Effects of dendritic cells transfected with full-length wild-type p53 and stimulated by gastric cancer lysates on immune response〔J〕. World J Gastroenterol， 2004， 10(17): 2595-2597

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篇5

腫瘤是機(jī)體中正常細(xì)胞在不同始動與促進(jìn)因素長期作用下,所產(chǎn)生的增生與異常分化形成的新生物。隨著疾病譜的改變，腫瘤已成為目前導(dǎo)致死亡的常見原因之一，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突飛猛進(jìn)，給科學(xué)技術(shù)方法研究帶來革命性變化，腫瘤逐漸地被看成為一種全身性疾?S紗碩矗琢鮒瘟乒勰畋惴⑸嗣饗緣淖潁琢鱟酆現(xiàn)瘟葡低徹塾υ碩?。紕?chuàng)酉低徹鄣慕嵌雀薟∪說幕遄純霾±聿∑謨敕⒄骨魘?有計(jì)劃地、合理地綜合應(yīng)用現(xiàn)有的各種治療手段,以期較大幅度地提高病人的生存率,改善病人的生存質(zhì)量。

1腫瘤發(fā)生、發(fā)展的系統(tǒng)觀

所謂系統(tǒng)是指若干要素按一定的結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系組成具有特定的功能的有機(jī)整體，而這個整體本身又是它所從屬的一個更大系統(tǒng)的一個組成部分。系統(tǒng)科學(xué)的觀點(diǎn)，就是要求把研究對象視為系統(tǒng)，把事物的普遍聯(lián)系和永恒運(yùn)動看成一個整體過程，全面的把握和控制，綜合的探索系統(tǒng)中要素與要素、要素與系統(tǒng)、系統(tǒng)與環(huán)境、系統(tǒng)與系統(tǒng)的相互作用和變化規(guī)律，把握住對象的內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境的關(guān)系，以便有效地認(rèn)識和改造對象［1］。任何系統(tǒng)都是開放的系統(tǒng)，每一個系統(tǒng)的存在都有整體性、層次性及動態(tài)平衡性等基本特征。一個生物學(xué)意義上的人，也完全可以看成是一個開放系統(tǒng)。這一系統(tǒng)本身就由各個子系統(tǒng)（循環(huán)、呼吸、消化等系統(tǒng)）組成，各系統(tǒng)之間并非獨(dú)立存在，有相互影響、相互制約的作用關(guān)系，這一大系統(tǒng)和外界進(jìn)行不斷的物質(zhì)和能量的交換，借以維持自身的穩(wěn)態(tài)，達(dá)到功能的最優(yōu)化，即生存質(zhì)量最佳化。所以有學(xué)者認(rèn)為：決定疾病發(fā)生發(fā)展的，不僅僅在于器官、組織、細(xì)胞、基因等各種要素的性能，更重要的是要素和要素之間，系統(tǒng)和環(huán)境之間的相互聯(lián)系和作用，考察疾病的本質(zhì)，必須把注意和焦點(diǎn)放在相互聯(lián)系和相互作用上［2］。上述說法就是從系統(tǒng)水平進(jìn)行考察，而不同局限于單個細(xì)胞或基因的功能行為。那么，在腫瘤的發(fā)生學(xué)上，是否肯定“基因決定論”的觀點(diǎn)呢？近幾年的研究提出，細(xì)胞基因的缺失、突變等導(dǎo)致的細(xì)胞生長失控、惡變是發(fā)生腫瘤的主要機(jī)制。從分子水平看，腫瘤的病因主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活，細(xì)胞周期調(diào)控基因的改變，前者是發(fā)病的基礎(chǔ)，并通過后者發(fā)揮作用。但對于這么一個子系統(tǒng)（核酸系統(tǒng)）的考察，并不能完全解釋腫瘤的發(fā)生。核酸系統(tǒng)之間，核酸與蛋白質(zhì)系統(tǒng)之間，核酸與神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)之間，核酸與內(nèi)、外環(huán)境之間均存在著千絲萬縷的聯(lián)系。癌基因的激活和抑癌基因的失活并不會無緣無故發(fā)生，研究已表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因、多步驟、多因素的漸進(jìn)過程。環(huán)境污染致癌因素的刺激，化學(xué)致癌因素如苯、氯霉素、亞硝酸胺的影響，物理致癌因素，腫瘤的病毒病因，其他如人體內(nèi)分泌失調(diào)、遺傳、慢性刺激和創(chuàng)傷均可致瘤。而且單因基因突變而產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞也未必能發(fā)展成腫瘤，在人體這樣一個復(fù)雜的系統(tǒng)中，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等內(nèi)環(huán)境隨時進(jìn)行警惕的監(jiān)視，只有整個大系統(tǒng)紊亂，監(jiān)視功能障礙，腫瘤細(xì)胞才能逃脫系統(tǒng)監(jiān)視，才能進(jìn)一步發(fā)展。而真正發(fā)展到器官的癌變，往往要經(jīng)歷數(shù)年甚至幾十年的時間，因?yàn)橐坏┫到y(tǒng)的功能恢復(fù)正常，腫瘤細(xì)胞可被機(jī)體清除，只有在內(nèi)外環(huán)境的反復(fù)作用下，機(jī)體各系統(tǒng)功能的紊亂無法再協(xié)調(diào)一致，才使得腫瘤得以發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移。綜上所述，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展并非“基因決定論”可以完全解決，相反的，只有從系統(tǒng)的整體的水平去考察外界環(huán)境和機(jī)體的作用，機(jī)體自身各個子系統(tǒng)的相互作用，每個子系統(tǒng)內(nèi)部各要素的相互關(guān)系，才能很好地認(rèn)識其病因和發(fā)病機(jī)制。

2系統(tǒng)方法論原則對腫瘤治療的思路指導(dǎo)

進(jìn)入20世紀(jì)之后，醫(yī)學(xué)漸漸進(jìn)入理性階段。隨著對腫瘤本質(zhì)認(rèn)識的不斷深入，更由于腫瘤局部治療方法的停滯不前，局部治療后預(yù)后不佳，使更多的學(xué)者意識到局部治療的弊端。20世紀(jì)80年代，惡性腫瘤的治療方式有手術(shù)、放療、化療、生物治療，其中以根治性手術(shù)為主，對失去手術(shù)機(jī)會的中晚期惡性腫瘤只通過單一的放療或化療來延長生存期，有效率低，易于復(fù)發(fā)，治療手段單一。80年代后期，由于化療藥物的不斷推陳出新，腫瘤學(xué)理論的不斷完善，化療的地位日益被重視，發(fā)展了誘導(dǎo)化療、術(shù)后化療、放化療、熱化療等各種綜合治療模式，手術(shù)方式也由根治性手術(shù)向保守性手術(shù)、保留器官功能方向發(fā)展，因此，21世紀(jì)的腫瘤治療更注重強(qiáng)調(diào)根據(jù)病人的身體狀況、腫瘤的病理類型、侵犯范圍（病期）和發(fā)展趨向，有計(jì)劃合理地應(yīng)用現(xiàn)有的治療手段，以期較大幅度的提高治愈率，改善病人的生活質(zhì)量，腫瘤治療觀念由此發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變，腫瘤綜合治療應(yīng)運(yùn)而生［3］。所謂腫瘤綜合治療是指：根據(jù)病人的機(jī)體狀況，腫瘤的病理類型，侵犯范圍（病期）和發(fā)展趨勢，有計(jì)劃地、合理地應(yīng)用現(xiàn)有的治療手段，制定個體化治療方案，以期大幅度地提高治愈率，改善病人的生存質(zhì)量［4］?？梢哉f，腫瘤治療學(xué)研究顯示出多學(xué)科的合作與補(bǔ)充，腫瘤的治療也已進(jìn)入綜合治療的時代。按照系統(tǒng)論整體性原理來講即系統(tǒng)論中各組分相加的和大于各組分的代數(shù)和。惡性腫瘤綜合治療個體化的決策，將手術(shù)、化療、放療、中醫(yī)中藥治療及生物基因治療，依照不同病例特點(diǎn)，進(jìn)行有機(jī)組合，以期達(dá)到最佳的治療效果［5］。但它不是將各種治療手段的簡單疊加或隨意輪番應(yīng)用，孰先孰后，孰輕孰重，均要因人而異，要經(jīng)過多學(xué)科的充分討論協(xié)商后決定。在決策過程中，既要注意盡量避免盲目一味強(qiáng)調(diào)某一學(xué)科在腫瘤治療中的重要性和單一治療方法在腫瘤治療中的過分?jǐn)U大應(yīng)用，又要注意各個學(xué)科之間的密切合作，相互配合，互補(bǔ)應(yīng)用，共同來承擔(dān)對患者的綜合治療。這就要求無論是哪一個學(xué)科的醫(yī)生，都要做到不僅能夠了解自己本學(xué)科治療手段的特點(diǎn)和不足，還要了解其他相關(guān)學(xué)科治療手段的特點(diǎn)和不足，真正做到心中有數(shù)。要能夠善于應(yīng)用其他相關(guān)學(xué)科的成果和特長來對自己本學(xué)科的治療加以充實(shí)、完善和提高。特別是在科學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展和技術(shù)更新速度不斷加快的今天，及時了解并掌握專業(yè)技術(shù)的發(fā)展動態(tài)和引進(jìn)先進(jìn)技術(shù)并加以應(yīng)用與創(chuàng)新，以跟上時代和科技發(fā)展的步伐。當(dāng)前，越來越多的腫瘤病人首診時都選擇到腫瘤內(nèi)科，主要是因?yàn)槟[瘤內(nèi)科的醫(yī)生能夠善于接受和利用新的醫(yī)學(xué)研究成果，以病人利益為重，改變過去誰先接診誰收治的不規(guī)范醫(yī)療行為，在對腫瘤病人的診斷以及設(shè)計(jì)和規(guī)劃總體治療策略上起到了主導(dǎo)作用，不僅能夠使腫瘤病人真正享受到現(xiàn)代腫瘤綜合治療模式與治療方案個體化所帶來的益處，而且也充分體現(xiàn)了社會的文明進(jìn)步與人文關(guān)懷［6～13］。我們在臨床工作中必須要按照醫(yī)學(xué)倫理學(xué)“醫(yī)乃仁術(shù)”和“循證醫(yī)學(xué)”，謹(jǐn)慎、準(zhǔn)確和明智地應(yīng)用當(dāng)前所能獲得的最好的研究證據(jù)，結(jié)合個人的專業(yè)技能和多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，考慮病人的經(jīng)濟(jì)承受能力和意愿，并將此結(jié)合最優(yōu)化的原則來作出具體的治療決策。例如目前放化療綜合治療的臨床應(yīng)用多集中于頭頸部癌、食管癌、乳腺癌以及肺癌中，通過放化療綜合治療所獲得的較高的局控率和較晚發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，為我們提供了一條中晚期惡性腫瘤治療的新途徑。靜脈化療起到了全身治療的目的－在于徹底清除微小轉(zhuǎn)移灶，放療作為一種局部治療，二者聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)不言而喻，中晚期惡性腫瘤傳統(tǒng)的單一治療模式已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)目前臨床要求，放化療綜合治療不僅提高生存率，對延緩發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也顯示出了不可比擬的優(yōu)越性，尤其是同期放化療的應(yīng)用將中晚期惡性腫瘤的治療帶上一個新的臺階［14］。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，作為生物醫(yī)學(xué)前沿的人類基因組計(jì)劃研究步入實(shí)質(zhì)性階段，基因治療腫瘤成為熱門。基因治療能否給人類帶來巨大的革命，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)大家的研究方向。所謂基因治療是指把目的基因?qū)氚屑?xì)胞和宿主體內(nèi)，通過基因組合，成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分，糾正錯誤的基因表達(dá)和基因表達(dá)的錯誤，以達(dá)到治療的目的［15］。通常包括四方面的內(nèi)容：基因修正-糾正缺陷基因的突變堿基序列；基因置換-由正常基因換掉疾病基因；基因修飾-將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞的基因，其表達(dá)產(chǎn)物用以修飾缺陷基因?qū)е碌募?xì)胞功能異常，或使正常功能得以加強(qiáng)；基因失活-應(yīng)用反義技術(shù)封閉不該表達(dá)的基因，以抑制有害基因，或直接抑制有害基因的表達(dá)。雖然就基因治療的概念來說，體現(xiàn)的是分子水平的基本理論和原則，但其治療的目的是為了抑制腫瘤的生長或達(dá)到逆轉(zhuǎn)、殺死腫瘤細(xì)胞，所以在治療過程中仍需考慮所作用的個體系統(tǒng)，如外界的環(huán)境因素，機(jī)體的內(nèi)環(huán)境和免疫功能的影響等。因?yàn)閷⒒驅(qū)爰?xì)胞，使正常基因得以表達(dá)，或使病變基因不表達(dá)，或誘導(dǎo)已有的腫瘤細(xì)胞分化、凋亡，都不是單單一個分子水平可以解決的。例如將反義基因?qū)爰?xì)胞，以封閉有害基因的表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中，所要觀察的指標(biāo)限于細(xì)胞水平，如基因轉(zhuǎn)染的百分率，對腫瘤細(xì)胞生長和抑制率等。但一旦進(jìn)入體內(nèi)實(shí)驗(yàn)階段，就不能不考慮機(jī)體的整體性，如反義核苷酸對腫瘤細(xì)胞有抑制作用，那么對正常細(xì)胞或組織器官是否有毒性作用呢？在體內(nèi)，在各種調(diào)節(jié)機(jī)制的作用下或各種核酸酶等水解酶的作用下，反義核苷酸是否能成功地進(jìn)入細(xì)胞封閉有害基因呢？再如用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有效性高并容易獲得穩(wěn)定表達(dá)，但這一插入突變是否會引起潛在的癌基因激活，從而又引發(fā)新的腫瘤呢？顯然，在腫瘤的基因治療的研究中，在體外細(xì)胞水平中有良好的效應(yīng)，但進(jìn)入機(jī)體系統(tǒng)中，其效果不一定良好，而且歷史上也有基因治療失敗的例子。這正是因?yàn)槿梭w是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，各個子系統(tǒng)之間有復(fù)雜的相互關(guān)系，而腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也并非由基因單獨(dú)決定，如果單從基因這一方面去考慮，而忽略了治療所處的整體環(huán)境，忽略了治療應(yīng)采取的整體措施，往往會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。任何對腫瘤疾病的治療方法需經(jīng)過人體內(nèi)試驗(yàn)，要從系統(tǒng)和整體的水平觀察治療有效性和可能存在的副作用，腫瘤基因治療也需遵循系統(tǒng)觀點(diǎn)，用整體性、動態(tài)性、聯(lián)系性的原理，達(dá)到最佳的預(yù)期效果。但在實(shí)際工作中，尚有許多疑難問題，對于這些問題解決離不開系統(tǒng)科學(xué)觀的支持，我們不能忽視機(jī)體的整體性，不能用局限、部分、分子細(xì)胞水平來以偏概全，只有用系統(tǒng)的環(huán)境中解決這些難題，才會有實(shí)用價值和臨床價值。所以從腫瘤的綜合治療可以看出，綜合手術(shù)、化療、放療及生物基因治療、中醫(yī)中藥治療、內(nèi)分泌治療等手段，依據(jù)具體情況具體分析的原則，針對具體的病例，制訂相應(yīng)的個性化的治療方案，最終達(dá)到最佳綜合療效，在某些領(lǐng)域已顯示了令人鼓舞的前景。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類表觀基因組協(xié)會（humnanepigenomeconsortium,HEC）在2003年10月正式宣布開始實(shí)施人類表觀基因組計(jì)劃（humanepigenomeproiect,HEP），通過大規(guī)模檢測人類基因組,基因組學(xué)研究進(jìn)入一個新的階段,也為解開生命奧秘及征服腫瘤等疾病帶來了希望［16］。人類攻克癌癥近在咫尺，但仍有很長的路要走，尚有不少難題有待在今后實(shí)踐中予研究解決。讓我們記住著名的系統(tǒng)科學(xué)家拉茲洛教授的話：“今天我們正目睹一場思維方式的轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)向嚴(yán)謹(jǐn)精細(xì)而又整體的理論。這就是說：要構(gòu)成擁有它們自己的性質(zhì)和關(guān)系集成的集合體，按照同整體聯(lián)系在一起的事實(shí)和事件來思考?！保?7］。

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篇6

中圖分類號：R273文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-2349（2011）11-0085-03

非小細(xì)胞型肺癌（nonsmallcelllungcancer，簡稱NSCLC），是發(fā)生于肺部的常見癌癥。根據(jù)病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)，可分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等不同類型，約占肺癌總數(shù)的80~85%[1]。目前治療以西醫(yī)治療為主，其中以手術(shù)治療、放療、化療為主要治療手段。中醫(yī)作為輔助療法不但可減輕放、化療所致的毒副作用，而且有利于放、化療順利進(jìn)行，在延長生存期等方面取得了較為滿意的療效。從總體治療效果看，NSCLC的臨床治療已取得很大進(jìn)展。本文就NSCLC的臨床中西醫(yī)治療進(jìn)展與展望作一綜述。

1外科治療

11一般手術(shù)治療一般手術(shù)治療仍然是目前治療早期非小細(xì)胞肺癌最理想的方法。手術(shù)方法有肺葉切除、一側(cè)全肺切除、袖式肺葉切除、氣管隆凸再造、氣管-肺動脈成形術(shù)等手術(shù)方法。同時需高度重視淋巴結(jié)清掃，只有通過系統(tǒng)肺門和縱隔淋巴結(jié)清掃才能達(dá)到完全切除和標(biāo)準(zhǔn)分期的目的。

12微創(chuàng)胸外科手術(shù)治療目前，肺癌微創(chuàng)外科技術(shù)主要有3種手術(shù)方式，即視頻輔助胸腔鏡手術(shù)（video-assistedthoracoscopicsurgery，VATS）、機(jī)器人輔助胸腔鏡手術(shù)（robot-assistedthoracoscopicsurgery，RATS）和保護(hù)胸壁肌肉的小切口開胸手術(shù)（muscle-sparingminithoracotomy，MSMT）。（1）VATS：目前中國多家胸外科中心已開展VATS肺癌切除術(shù)，在2008年第8次全國胸心血管外科學(xué)術(shù)會議上，華西醫(yī)院劉倫旭介紹了更具有操作性、更加規(guī)范的“單向式胸腔鏡肺葉切除術(shù)”，標(biāo)志著中國VATS肺癌切除術(shù)的成熟。（2）RATS：近年，機(jī)器人已被引入外科手術(shù)中，這揭示了未來胸外科的發(fā)展趨勢和方向[2]。2006年美國紐約紀(jì)念醫(yī)院[3]報告了34例RATS肺葉切除的臨床資料，無手術(shù)死亡，4例（12%）中轉(zhuǎn)開胸，平均清除4組淋巴結(jié)，中位手術(shù)時間218min，中位胸腔引流時間3d，中位住院時間45d。（3）MSMT：隨著器械外科技術(shù)的進(jìn)步和小切口下手術(shù)操作技巧的提高，經(jīng)MSMT可方便地施行與傳統(tǒng)開胸手術(shù)相同的解剖性肺切除和系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃，已能對絕大多數(shù)具備手術(shù)適應(yīng)證的肺癌實(shí)施根治性切除，獲得與傳統(tǒng)后外側(cè)切口肺癌切除術(shù)相同的治療結(jié)果。

2化療

目前化療方案大致可分為兩類：以鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合方案和不含鉑類藥物的方案。（1）以鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合方案是目前治療NSCLC較常用的一種手段，藥物的組合方式也有多種，鉑類聯(lián)合新藥是目前治療的首選方案[4]。對于有良好預(yù)后因素的晚期NSCLC患者采用聯(lián)合順鉑與健澤、紫杉醇、異長春花堿化療取得了令人滿意的有效率；對于沒有良好預(yù)后因素或老年患者，采用異長春花堿、健澤或紫杉醇單藥治療更為合適[5]。（2）不含鉑類藥物的方案藥物主要是紫杉醇、多西他賽、泰素帝、吉西他濱等。目前最引人注目的方法是“TXT”（泰索帝）75mg/m2（毫克每平方米體表面積）單一藥物治療[6]。

3放療

根據(jù)目前的研究，放療可分為術(shù)前放療、術(shù)中放療和術(shù)后放療3種方法。術(shù)前放療的目的為清除手術(shù)區(qū)域以外的亞臨床病變，減小腫瘤體積以及相鄰組織之間的浸潤，減少局部種植和轉(zhuǎn)移的機(jī)會，以提高切除率和生存率。但是臨床實(shí)踐顯示上述目的未能達(dá)到，并沒有使患者受益，臨床上已不常規(guī)采用[7]。術(shù)中放療的目的是降低局部復(fù)發(fā)率，是近年發(fā)展的在手術(shù)殘留部位以電子線進(jìn)行的一次性大劑量（15gy～25gy）照射，手術(shù)傷口愈合后再行體外高能放療。術(shù)后放射治療可提高生存率，對于手術(shù)中癌腫組織未能全部切除或支氣管斷端殘留癌浸潤的病例可放置金屬標(biāo)記行放療。

4分子靶向治療

分子靶向治療比傳統(tǒng)的化療具有更高的選擇性，毒副作用小，是今后腫瘤治療的新趨勢[8]。目前臨床應(yīng)用的分子靶向治療藥物主要有以下3類：（1）作用于表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑是一種跨膜蛋白，為原癌基因EerB1（Her21）的表達(dá)物。這類藥物包括易瑞沙和埃羅替尼等多種藥物。（2）作用于血管生成的靶向藥物是一種重組人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體，由培養(yǎng)在含慶大霉素培養(yǎng)基中的中國倉鼠卵巢哺乳細(xì)胞表達(dá)體系生產(chǎn)。這類藥物主要有貝伐單抗等。（3）多靶點(diǎn)治療藥物是一種口服多靶點(diǎn)治療藥物，能選擇性地抑制血管內(nèi)皮生長因子依賴的腫瘤血管形成，而且對表皮生長因子受體也有一定抑制作用。這類藥物有ZD6474等。

5免疫治療

51主動免疫療法主要有非特異性主動免疫療法和特異性主動免疫療法。（1）非特異性主動免疫療法：目前主要應(yīng)用具有免疫調(diào)節(jié)作用的刺激因子通過非特異性的作用激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤的免疫應(yīng)答。如卡介苗、短小棒狀桿菌、左旋咪唑等，也可用細(xì)胞因子如白介素-2、白介素-4、干擾素、腫瘤壞死因子等。但由于肺癌的腫瘤抗原性不強(qiáng)，目前這種治療難以取得明顯效果。（2）特異性主動免疫療法：隨著對腫瘤免疫研究的深入，腫瘤疫苗和抗獨(dú)特性抗體作為疫苗的發(fā)現(xiàn)使特異性主動免疫療法成為可能[9]。某些抗獨(dú)特性抗體與抗體上的抗原相關(guān)位點(diǎn)結(jié)合，能夠模擬外來抗原，作為免疫治療中替代性抗原。

52被動免疫療法主要有過繼免疫療法和抗體療法。（1）過繼免疫療法：目前肺癌的過繼免疫療法可以應(yīng)用淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）輸入體內(nèi)或局部應(yīng)用于癌性胸水，對延緩病情的發(fā)展有一定的效果，但單獨(dú)應(yīng)用治療效果不佳。還可以應(yīng)用腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TIL），通過基因修飾的TIL進(jìn)行治療。實(shí)踐證明TIL的療效比LAK要更好。（2）抗體療法：目前抗體療法正成為肺癌的另一研究熱點(diǎn)，它已成為肺癌綜合治療的一部分。運(yùn)用相應(yīng)的單克隆抗體與異常表達(dá)的癌基因產(chǎn)物結(jié)合可以阻斷癌細(xì)胞的異常信號傳導(dǎo)通路，從而阻止癌癥的發(fā)展[10]。

6介入治療

目前介入治療在NSCLC應(yīng)用的方法主要有兩種，即經(jīng)支氣管動脈灌注化療和支氣管栓塞治療。經(jīng)支氣管動脈灌注化療可有效提高腫瘤局部藥物濃度，提高抗癌藥物的解毒作用，同時又可以減少或阻斷腫瘤的血供，使其縮小、壞死。支氣管栓塞治療可通過介入放支架解除腫瘤引起的中心氣道狹窄或阻塞，對繼發(fā)于肺癌的上腔靜脈綜合征患者血管內(nèi)置人支架是較好的方法。

7基因治療

基因治療在該病所應(yīng)用的方法主要有[11]誘導(dǎo)特異性免疫的基因治療和直接作用的基因治療兩種。誘導(dǎo)特異性免疫的基因治療即輸送生物活性基因來改變癌細(xì)胞的局部免疫環(huán)境，增加癌細(xì)胞的免疫原性和T細(xì)胞的反應(yīng)性，改善抗原提呈和提供缺失的旁分泌。由于免疫性誘導(dǎo)是遺傳性系統(tǒng)性的，同時靶子來源于腫瘤抗原，因此所誘導(dǎo)的免疫性具有潛在發(fā)現(xiàn)和殺死沒有經(jīng)過基因修改的腫瘤細(xì)胞。這一特點(diǎn)可能對以遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為主要問題的肺癌具有重要意義。直接作用的基因治療主要有抑癌基因的治療、藥敏感性基因治療和反義cDNA和寡核苷酸技術(shù)3種方法。

8中醫(yī)藥治療

中醫(yī)學(xué)側(cè)重辨證施治，從整體調(diào)節(jié)入手，目前中醫(yī)藥在治療肺癌中，特別是在NSCLC的防治方面主要有以下作用：（1）防治手術(shù)、放療、化療副反應(yīng)；（2）配合手術(shù)、放療、化療減毒增效；（3）在抗非小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的綜合治療中起很重要的作用；（4）不能手術(shù)、放療，不宜再化療的肺癌患者，中醫(yī)起主導(dǎo)作用，即改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生存期[12]。

81病因病機(jī)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺癌屬“肺積”“痞癖”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等范疇，病位在肺。學(xué)者們對其病因病機(jī)雖然有不同的認(rèn)識，但無外乎正氣虛損和邪毒內(nèi)積兩個方面，本病病變部位在肺，與脾、腎有關(guān)，病理因素主要為氣滯、痰濁、瘀血、熱毒，病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)錯雜。在治療過程中，扶正培本為其關(guān)鍵。

劉麗坤等[13]認(rèn)為，肺癌的基本病機(jī)為正虛邪實(shí)。正虛是肺癌發(fā)生的基礎(chǔ)，是復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，其中肺陰虧虛貫穿疾病的始終，痰瘀毒結(jié)是肺癌的主要病理表現(xiàn)。劉嘉湘認(rèn)為肺癌總屬本虛標(biāo)實(shí)，由于正氣先傷，邪氣得以乘虛而入，聚積于肺，導(dǎo)致氣滯血瘀、聚液為痰、痰瘀交阻而漸成腫塊。高萍等認(rèn)為放化療副反應(yīng)是毒邪內(nèi)侵，損害肝脾腎等臟腑功能，耗傷機(jī)體氣血津液，導(dǎo)致氣血陰陽的失調(diào)與缺失。

82辨證分型中醫(yī)將肺癌看作是全身性疾病的一個局部表現(xiàn)，主要根據(jù)癥狀和體征對肺癌進(jìn)行辨證分型，治療上強(qiáng)調(diào)全面調(diào)整人體機(jī)能。目前主要依據(jù)陰陽盛衰、氣血的虛實(shí)、臟腑病機(jī)以及邪毒性質(zhì)進(jìn)行歸類分型。這些證型基本反映了肺癌病情發(fā)展不同階段的一些規(guī)律。劉嘉湘對405例非小細(xì)胞肺癌病例進(jìn)行研究，其中陰虛和氣陰兩虛型占肺癌的726%，指出肺癌的病機(jī)特點(diǎn)以陰虛和氣陰兩虛為主。楊國旺等將肺癌劃分為氣虛、陰虛、陽虛、血虛、痰濕、血瘀、毒熱7個基本證型。李忠等研究發(fā)現(xiàn)以氣陰兩虛及痰瘀互阻證型最為常見，其他依次為脾虛痰濕、肺脾氣虛、氣虛血瘀、痰濕阻滯等。孫士玲分為肺脾氣虛、肺，胃陰虛、肺熱痰濕、氣滯血瘀型。

83中成藥中醫(yī)藥作為一個輔助療法，在非小細(xì)胞肺癌的治療中起到了很大的作用。隨著中藥制劑現(xiàn)代化研究，研制成了很多中成藥，有很好的臨床療效。目前臨床上使用的口服中成藥有固本消瘤膠囊、乾坤膠囊、平消膠囊、抗瘤沖劑、仙露沖劑、中成藥鶴蟾片、參一膠囊等。治療NSCLC的中藥靜脈制劑主要有康萊特注射液、參麥注射液、丹參注射液、艾迪注射液、華蟾素、欖香烯、巖舒注射液等。

9回顧與展望

非小細(xì)胞肺癌的手術(shù)、放療、化療和生物治療等在臨床治療上已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是治療效果仍不能令人滿意。中醫(yī)藥作為一個補(bǔ)充治療手段和方法正起到越來越重要的作用。中醫(yī)的整體觀從大局出發(fā)，提倡提高機(jī)體正氣抗邪，防止病情進(jìn)展，正彌補(bǔ)了西醫(yī)重局部的不足。中醫(yī)藥治療肺癌的療效以病灶穩(wěn)定率較高、生存期較長、改善生活質(zhì)量較好為主要特點(diǎn)，在抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，減負(fù)增效方面有一定的優(yōu)勢，對于已無放化療機(jī)會晚期肺癌患者，中醫(yī)藥治療是緩解疾苦的主要手段。但是中醫(yī)治療在很多方面還不完善，比如辨證分型缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識，臨床應(yīng)用個案報道數(shù)量較多，缺乏大樣本、多因素的觀察，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)并不充分等。

筆者認(rèn)為目前西醫(yī)治療一方面微創(chuàng)手術(shù)研究是未來外科手術(shù)的發(fā)展方向，另一方面靶向治療、免疫治療和基因治療都是肺癌多學(xué)科治療中新的研究和應(yīng)用熱點(diǎn)，日益受到重視，是以后發(fā)展的方向。要注意提高藥物療效，降低毒副作用，延長患者（尤其是晚期肺癌患者）的生存期。中醫(yī)治療應(yīng)從扶正祛邪，整體調(diào)節(jié)入手，應(yīng)特別重視調(diào)補(bǔ)肺臟功能兼顧調(diào)整五臟功能。具體來說，整體方面要調(diào)理飲食，注意飲食平衡；調(diào)理藥物，注意藥物之間的平衡，勿太過不及；調(diào)理五臟功能，勿偏盛偏衰。局部方面要注意調(diào)整肺臟本身的功能和調(diào)整脾胃功能。中醫(yī)認(rèn)為“人以胃氣為本”、“脾胃為后天之本，為氣血生化之源”，脾胃功能好壞對疾病的預(yù)防和治療都有很重要的作用，尤其在肺癌的防治中更是具有重要價值。未來該病的治療必將走上一條中西醫(yī)互補(bǔ)的道路，因而希望能夠多學(xué)科配合、大膽摸索、反復(fù)實(shí)踐，更好的發(fā)揮中西醫(yī)結(jié)合在NSCLC預(yù)防治療中的特色和優(yōu)勢，從而對人類防治NSCLC整體水平的提高起到積極地推動作用。

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篇7

中圖分類號：G642.41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）03-0119-02

基因工程又稱為基因拼接或者DNA重組技術(shù)，是將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。1972年美國人Berg在基因工程基礎(chǔ)研究方面做出了突出貢獻(xiàn)，被公認(rèn)為“基因工程之父”。1973年美國人Cohen等用核酸限制性內(nèi)切酶EcoRI，首次基因重組成功。近些年來，基因工程的新概念、新理論及新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，內(nèi)容也在不斷豐富與充實(shí)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域[1，2]。21世紀(jì)以來，基因組學(xué)已進(jìn)入功能基因組學(xué)時代，對基因功能的研究是生物技術(shù)發(fā)展的新方向，體現(xiàn)了基因工程的重要價值所在?；蚬こ虒W(xué)作為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域最具生命力、最引人關(guān)注的前沿學(xué)科之一，已經(jīng)發(fā)展成為現(xiàn)代分子生物學(xué)、技術(shù)學(xué)的核心內(nèi)容，其課程質(zhì)量的好壞直接關(guān)系學(xué)生的專業(yè)素質(zhì)和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。作者所在學(xué)院（浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院）于2007年新增了生物技術(shù)專業(yè)，同時開設(shè)了基因工程課程。為了不斷提高該課程的教學(xué)水平，筆者結(jié)合這幾年的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)以及兄弟院校相關(guān)課程的授課經(jīng)驗(yàn)，努力充實(shí)教學(xué)內(nèi)容，不斷更新教學(xué)手段，對基因工程課程的教學(xué)體系進(jìn)行了探索式改革。

一、教學(xué)內(nèi)容

1.不斷更新教學(xué)內(nèi)容，突出實(shí)用性?；蚬こ汤碚撟鳛橐环N專業(yè)性很強(qiáng)的課程，需在學(xué)生有一定生物學(xué)知識的基礎(chǔ)上教學(xué)。在浙江海洋學(xué)院本課程于大三下學(xué)期開課，在此之前學(xué)生已修完細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等生物學(xué)基礎(chǔ)課程，具備了較完整的理論知識體系，在此基礎(chǔ)上開展教學(xué)，有利于學(xué)生對知識的理解和掌握?；蚬こ套鳛橐环N技術(shù)性很強(qiáng)的課程，與上述生物學(xué)基礎(chǔ)課程關(guān)系密切，同時與酶工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程等學(xué)科緊密聯(lián)系，存在一定的內(nèi)容重復(fù)。在教學(xué)過程中，對于此類重復(fù)，或一筆帶過，點(diǎn)到為主，或采用實(shí)例對重要知識加以鞏固，盡量避免重復(fù)，突出課程特色。教材是提高教學(xué)質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，浙江海洋學(xué)院第一次即2010年選用的《基因工程》教材由高等教育出版社出版，孫明教授主編。該教材內(nèi)容全面翔實(shí)、章節(jié)清晰，對基因工程的原理、策略和技術(shù)方法均有系統(tǒng)介紹，具有很強(qiáng)的理論性和前瞻性。但是其內(nèi)容較多，很多內(nèi)容對于二本院校本科生來講過于深奧、難以理解，學(xué)生也反映該教材較難，建議選其他較易理解的教材。結(jié)合該院校是二本院校的實(shí)際，筆者從2011年開始使用袁鶩洲主編，化學(xué)工業(yè)出版社出版的《基因工程》，屬普通高等教育規(guī)劃教材。本教材為國家精品課程教材，主要介紹了基因工程的基本概念、基本原理、常用基因工程操作技術(shù)以及基因工程與功能基因組學(xué)相結(jié)合的技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展。主要內(nèi)容包括三大塊。一是基因工程的基本原理與基本技術(shù)，包括工具酶和克隆載體。表達(dá)載體及常用的基因表達(dá)系統(tǒng)，目的基因獲取、制備、擴(kuò)增、導(dǎo)入與鑒定的各種方法。二是基因工程在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用，包括基因表達(dá)譜的研究技術(shù)，全基因組化學(xué)誘變、轉(zhuǎn)座子飽和誘變的技術(shù)，基因敲除與基因敲減的技術(shù)，GAL4/UAS過表達(dá)系統(tǒng)，酵母雙雜交及免疫共沉淀等蛋白質(zhì)相互作用研究的技術(shù)等。三是基因工程在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，包括轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物的制備與應(yīng)用，基因治療的原理與策略以及基因工程藥物的研制與現(xiàn)狀等。該教材內(nèi)容清晰易懂，實(shí)例舉證充分，且涉及基因工程在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，在一定程度上可以提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。使用該教材3年來，目前感覺學(xué)生反映較好，適合該校學(xué)生使用。

2.引領(lǐng)學(xué)生了解前沿動態(tài)?；蚬こ套鳛橐婚T前沿學(xué)科，發(fā)展速度快，內(nèi)容日新月異。我們常用教材多側(cè)重原理、基礎(chǔ)等理論知識，且更新速度始終落后于基因工程技術(shù)本身的發(fā)展速度?，F(xiàn)代學(xué)生思維活躍，求知欲強(qiáng)。為了充分滿足學(xué)生的求知欲和好奇心，在基因工程教學(xué)過程中，盡可能地添加一些新成果、新理論和新技術(shù)[3]，如：生物能源，基因工程疫苗的開發(fā)，基因治療等，并結(jié)合自己在國外實(shí)驗(yàn)室所學(xué)向同學(xué)們展示最新技術(shù)與相關(guān)研究進(jìn)展?；蚬こ痰男录夹g(shù)多發(fā)表于Science、Nature、Cell等頂尖雜志，在教學(xué)過程中，對于發(fā)表的經(jīng)典新成果，嘗試讓學(xué)生自己閱讀、分段翻譯、小組討論，增加對新知識的了解[3]。一些重要的生命科學(xué)論壇，如：生物谷、丁香園、小木蟲等是生命科學(xué)領(lǐng)域研究人員交流學(xué)習(xí)的地方，而知識的碰撞最容易產(chǎn)生科學(xué)的火花。因此，鼓勵學(xué)生瀏覽這些論壇，并參與討論，增強(qiáng)學(xué)習(xí)興趣。另外，也鼓勵他們加入相關(guān)的QQ群，比如轉(zhuǎn)基因群、生物信息群，增加同業(yè)交流，為自己拓寬理論知識和解決實(shí)際技術(shù)問題，同時也為今后從事的相關(guān)工作打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

二、教學(xué)手段和教學(xué)方法多元化

不像動物學(xué)、植物學(xué)可以直觀地看到實(shí)物，基因工程內(nèi)容抽象，多涉及細(xì)胞、分子等微觀內(nèi)容，且高新技術(shù)多，操作流程長，如果僅僅采用文字和語言表述，難以講授明白，學(xué)生學(xué)起來也比較晦澀難懂[4]。因此，需要運(yùn)用多種教學(xué)方法，使概念、原理講得通俗易懂，學(xué)生理解起來就更容易。

1.多媒體教學(xué)的應(yīng)用。目前，大部分高校已廣泛采用多媒體教學(xué)。在基因工程多媒體教學(xué)過程中，改變原來單純的文字、圖片等內(nèi)容，不斷嘗試加入一些聲音、錄像、動畫等信息，使課堂圖文并茂、有聲有色、栩栩如生，便于學(xué)生理解并強(qiáng)化記憶。如在講解“PCR反應(yīng)”一節(jié)中，自己錄取了PCR的準(zhǔn)備、操作以及電泳檢測等全套過程，老師講得省心，同學(xué)們聽得舒心，極大提高了基因工程課程的教學(xué)效果。

2.小組討論式教學(xué)。有價值的討論是促進(jìn)學(xué)生開動腦筋、舉一反三、加深認(rèn)識的有效手段。在遇到抽象內(nèi)容時，講解完畢后，鼓勵學(xué)生分組討論，并選出一名組長上講臺以PPT的形式匯報本小組的學(xué)習(xí)心得，組長實(shí)行輪換制。下面的同學(xué)給匯報的小組分別從以下幾方面打分：匯報PPT的表現(xiàn)，制作PPT的質(zhì)量，所講內(nèi)容的條理性、創(chuàng)新性以及講解能力。通過此手段，極大調(diào)動了學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。例如，可引導(dǎo)學(xué)生討論以下專題：①轉(zhuǎn)基因動物；②中國的轉(zhuǎn)基因水稻；③基因工程產(chǎn)品的安全性；④基因治療。

三、改革實(shí)驗(yàn)教學(xué)、科研項(xiàng)目與課程教學(xué)相結(jié)合

本?；蚬こ虒?shí)驗(yàn)是在大三結(jié)束后的暑假短學(xué)期開展的，共16學(xué)時，這時學(xué)生已上完基因工程理論課，具備了實(shí)驗(yàn)操作的相關(guān)理論知識。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容至關(guān)重要，是理論知識的綜合運(yùn)用。那么如何選擇實(shí)驗(yàn)內(nèi)容呢？這一點(diǎn)比較關(guān)鍵。授課教師多具有博士學(xué)位，承擔(dān)著較高水平的科學(xué)研究工作。在基因工程教學(xué)過程中，嘗試將實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和教師的科研項(xiàng)目相結(jié)合，讓學(xué)生自主參與到科研項(xiàng)目的研究中。學(xué)生可根據(jù)教師的科研項(xiàng)目自主確定實(shí)驗(yàn)課程內(nèi)容，從實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的選擇，到實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)、試劑的購置、實(shí)驗(yàn)步驟的進(jìn)行等都由學(xué)生自主完成，老師在此過程中起指導(dǎo)作用。筆者將課題“曼氏無針烏賊微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建”分解成幾個小實(shí)驗(yàn)，包括PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)、載體連接、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選與鑒定、測序、序列分析和引物設(shè)計(jì)等，指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行整個流程實(shí)驗(yàn)，使其知識更具有系統(tǒng)性、完整性。此外，還可鼓勵學(xué)生申報省級或校級的大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目，由筆者指導(dǎo)的“轉(zhuǎn)基因綠色熒光觀賞魚開發(fā)技術(shù)探索”以及“青魚β-actin基因的啟動子功能初步檢驗(yàn)”分別獲得省級可喜獎項(xiàng)，這個實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新能力及今后獨(dú)立從事科研的能力。

四、試探采用雙語教學(xué)

現(xiàn)代高素質(zhì)專業(yè)人才不僅要具備高水平的專業(yè)知識，還應(yīng)具備高水平的專業(yè)外語閱讀與寫作能力。為適應(yīng)學(xué)科發(fā)展趨勢，并擴(kuò)充學(xué)生的英語專業(yè)詞匯，培養(yǎng)英語思維模式，在基因工程教學(xué)過程匯總嘗試進(jìn)行雙語教學(xué)[5]。在教學(xué)上，以中文課件為主，主要的專業(yè)詞匯用英文標(biāo)注，時而用英文講解，盡量創(chuàng)造雙語教學(xué)環(huán)境。并且鼓勵學(xué)生借閱相關(guān)的英文教材，例如，在國際上使用廣泛，權(quán)威性和時代感強(qiáng)的英文教材《Principles of gene manipulation and genomics》（7th ed）作為教學(xué)參考書。

簡而言之，經(jīng)過幾年的努力工作，浙江海洋學(xué)院在基因工程課程的教學(xué)內(nèi)容方面進(jìn)行了優(yōu)化，改進(jìn)了教學(xué)方法與手段，培養(yǎng)了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力和創(chuàng)新意識，拓展了他們的知識面，取得了不錯的效果。然而，課程教學(xué)改革是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，目前還處于探索和實(shí)踐階段，必須堅(jiān)持不斷地探索、實(shí)踐、總結(jié)，最好建立一支教學(xué)團(tuán)隊(duì)，希望把基因工程課程教學(xué)改革工作開展得更有效果，為國家輸送更多高素質(zhì)的專業(yè)人才。

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篇8

尤為業(yè)內(nèi)矚目的是，汪道文教授在國內(nèi)率先建立和開展了心腦血管病新危險因素的檢測臨床研究，并率先開展了疾病的基因診斷和以基因診斷與分型為基礎(chǔ)的個體化診斷醫(yī)療。他和他的團(tuán)隊(duì)先后開展基因診斷項(xiàng)目600余項(xiàng)，為臨床解決了大量疑難問題；在心律失常、肥厚型心肌病、嬰兒黃疸和大血管疾病等的基因診斷方面走在了國際前列。

陽春三月，在第六屆國際心血管病靶向治療論壇（CTT 2015）召開期間，本刊記者就“疾病的基因診斷和基因診斷與分型”以及基于此的“疾病個體化診斷醫(yī)療”等話題，對汪道文教授作了深入采訪。

“量體裁衣”，

基因診斷助推個體化醫(yī)療

采訪一開始，汪道文教授首先詮釋說：“隨著人類基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)及分子生物學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，人們對疾病多成因、異質(zhì)性及個體化差異的特點(diǎn)有了更加全面的認(rèn)識。個體化治療已成為臨床治療的發(fā)展方向和最有效的手段；個體化醫(yī)療的理念也被推至前臺，已被越來越多的科研工作者和臨床醫(yī)生所認(rèn)識和接受?！?/p>

汪道文教授進(jìn)一步解釋說，所謂個體化醫(yī)療（Personalized Medicine， Individualized Medicine），即認(rèn)定病人對不同藥物和治療反應(yīng)的遺傳學(xué)變異，針對致病分子靶向治療； 此外，還發(fā)展和利用以遺傳和分子機(jī)制的診斷，以更好地預(yù)測對靶向治療的反應(yīng)。

他認(rèn)為：“基于基因診斷技術(shù)的個體化醫(yī)療之根本，在于根據(jù)病人個體的遺傳結(jié)構(gòu)差異，實(shí)現(xiàn)‘量體裁衣’式的個體化用藥方式，而這將成為未來理想的治病新模式。但從臨床上看，早期預(yù)測，個體化的治療并非像簡單的遺傳變異分析那樣簡單。個體化醫(yī)療的一個重點(diǎn)就是強(qiáng)調(diào)提前干預(yù)。如果通過基因測序發(fā)現(xiàn)有糖尿病或者心血管疾病發(fā)病風(fēng)險，就可以在飲食方面做一些先行調(diào)整，改善營養(yǎng)平衡，延緩降低發(fā)病幾率和時間；可以在人們尚無任何癥狀的情況下，通過基因檢測預(yù)測1年或5年以后患有某些疾病的風(fēng)險有多大，比如某好萊塢電影明星有乳腺癌家族史，她通過基因檢測發(fā)現(xiàn)帶有乳腺癌遺傳突變基因，于是就做預(yù)防性切除術(shù)，降低了患癌風(fēng)險。這就是典型的在發(fā)病以前進(jìn)行積極干預(yù)的事例。因此隨著個體化醫(yī)療的逐步發(fā)展，針對個體化的檢查和監(jiān)測將成為現(xiàn)實(shí)。而這將對心血管疾病的早期檢測和干預(yù)提供極大的幫助，對心血管疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷治療及預(yù)后的改善，產(chǎn)生積極影響?！?/p>

汪道文教授繼續(xù)詮釋說，個體化醫(yī)療中所謂的“量體裁衣”，是指根據(jù)服務(wù)對象在生物分子水平的特征，制定有針對性的保健措施和治療方案。在這方面，藥理遺傳學(xué)的興起極大地推動了個體化醫(yī)療的發(fā)展；特別是在心血管領(lǐng)域，藥理遺傳學(xué)已經(jīng)成為一門熱門的研究方向，最有代表性的就是華法林的個體化用藥及抗血小板藥的個體化選擇。近年來，隨著藥物基因組學(xué)的不斷深入，依賴于藥理遺傳學(xué)的結(jié)果而建立起來的華法林維持劑量應(yīng)用模型，不斷地在嘗試應(yīng)用于臨床。

據(jù)了解，在最近的AHA會議上，EU-PACT研究發(fā)現(xiàn)按基因型確定華法林劑量，優(yōu)于使用臨床標(biāo)準(zhǔn)劑量（N Engl J Med. 2013 Nov 19）。對此汪道文教授談到：“確實(shí)，我們同濟(jì)醫(yī)院心血管實(shí)驗(yàn)室已完成了近1000例患者基因分型指導(dǎo)華法林劑量的調(diào)整。我們的臨床實(shí)踐證明，通過基因分型，按照藥理遺傳學(xué)模型能非常準(zhǔn)確有效地指導(dǎo)臨床華法林應(yīng)用，可大大減少INR的檢查和降低由于用量問題帶來的風(fēng)險。因此我們相信，隨著研究的繼續(xù)深入和藥物治療模式的不斷改進(jìn)，臨床上采用以藥物遺傳學(xué)為基礎(chǔ)實(shí)行華法林的個體化治療時代已經(jīng)來臨！”

“4P醫(yī)學(xué)”將在未來

真正得以實(shí)現(xiàn)

采訪前記者獲悉，學(xué)術(shù)界曾有一種看法：目前開展的人類基因測序產(chǎn)生了海量數(shù)據(jù)，這至少帶來了兩個問題，一是存儲所占空間太大，傳輸、計(jì)算也會變得很慢；二是如何篩選有用數(shù)據(jù)的難度也進(jìn)一步增大。那么，在心血管疾病的基因診療方面，如何有效用好海量數(shù)據(jù)、提高診斷治療效果？

對此問題，汪道文教授介紹說：“對于高通量測序帶來的巨大數(shù)據(jù)量，我們的做法是，引進(jìn)專業(yè)服務(wù)器對數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲和分析。這一方面緩解了海量數(shù)據(jù)帶來的存儲壓力，另一方面經(jīng)數(shù)據(jù)處理的本地化相比數(shù)據(jù)上傳至云端，原始測序數(shù)據(jù)就能得到更快、更全面的分析，大大提高了工作效率。”

汪道文教授也認(rèn)為，高通量測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)，的確對數(shù)據(jù)的分析和采用提出了更高的要求，而從龐雜的突變（或多態(tài)性位點(diǎn)）中準(zhǔn)確識別致病突變，既是高通量測序技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測的基本要求，同時也是難點(diǎn)之一。針對這些問題汪道文教授解釋說：“在數(shù)據(jù)分析過程中，我們的科研技術(shù)人員會經(jīng)過數(shù)據(jù)的篩選，數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)庫的比對，并結(jié)合臨床，最終判斷一個突變是不是致病突變?？偟膩碚f，致病突變的識別，一部分來自于已有的基礎(chǔ)研究，我們的研究技術(shù)人員必須掌握前沿的科研成果，并及時更新我們已有的突變數(shù)據(jù)庫，以準(zhǔn)確識別致病突變；對于一些我們認(rèn)為有價值但還沒有研究基礎(chǔ)的可疑致病突變，我們也會深入地開展功能相關(guān)研究，將我們自己的研究成果運(yùn)用于臨床檢測。另外，表型和突變聯(lián)系緊密的家系，也能為我們提供報道致病突變的依據(jù)。只有充分掌握疾病的相關(guān)遺傳學(xué)研究成果，并積極開展表型-基因型關(guān)系的研究，建立嚴(yán)格的致病突變識別流程，才能準(zhǔn)確并高效地將高通量測序技術(shù)應(yīng)用到臨床診療，否則，龐雜的測序數(shù)據(jù)對病人來說，無異于一部‘天書’，而為病人準(zhǔn)確地解讀這部‘天書’，則是相關(guān)從業(yè)人員的責(zé)任?！?/p>

在采訪中汪道文教授強(qiáng)調(diào)：“需要指出的是，現(xiàn)在人類的基因組測序已經(jīng)完成，但是具體單個基因或者某一段基因與疾病的關(guān)聯(lián)性的研究，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，而這也是全世界科研工作者正在努力的方向；特別是在國內(nèi)，基因診斷才剛剛起步，個體化醫(yī)療的路程還很長，但我們堅(jiān)信，隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，我們對于許多疾病的分子機(jī)制會了解得更加深刻。個體化醫(yī)療將會在基因分子層面早期預(yù)測疾病，從而降低發(fā)病風(fēng)險，延緩發(fā)病時間，最終改善患者預(yù)后。另一方面，個體化醫(yī)療的發(fā)展與臨床息息相關(guān)，這需要不斷加強(qiáng)對臨床醫(yī)生的教育和培訓(xùn)。以美國為例，臨床醫(yī)生的培訓(xùn)對于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的要求是比較高的，許多人進(jìn)入臨床工作以后，仍然在分子生物學(xué)、生物化學(xué)等方面有很好的造詣。這一點(diǎn)對于中國來說還比較欠缺，這也是阻礙我們臨床醫(yī)生水平提高的障礙之一。針對這些問題，我們曾經(jīng)舉辦過‘全國基因診斷與基因分型臨床應(yīng)用學(xué)習(xí)班’，其目的就是希望我們能通過舉辦學(xué)習(xí)班，將基因診斷及個體化醫(yī)療的概念灌輸?shù)矫恳粋€人的腦海中，將分子醫(yī)學(xué)的種子播散到每一個人的心田；同時通過培訓(xùn)，也希望他們將基因診斷及個體化醫(yī)療的意識帶回到本科室、本醫(yī)院、本地區(qū)，以此在全國范圍內(nèi)逐步普及基因診斷及個體化醫(yī)療的相關(guān)知識。”

此前記者了解到，隨著抗血小板藥物的廣泛使用，人們發(fā)現(xiàn)并不是所有規(guī)則用藥的患者都能獲得一致的臨床療效。近年的研究表明，長期應(yīng)用抗血小板藥物，導(dǎo)致約50%的患者療效降低或無效。汪道文教授曾長期進(jìn)行基因多態(tài)與抗血小板的治療研究，那么，這項(xiàng)研究將會給抗血小板臨床治療帶來哪些影響？

對此問題，汪道文教授談到：“根據(jù)血小板功能和個體化基因型采用個體化抗血小板策略，仍然是心血管領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。更廣泛地開展個體化抗血小板治療，以帶來心血管預(yù)后的改善，仍然需要更多的臨床試驗(yàn)結(jié)果支持。同時，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用全基因組關(guān)聯(lián)研究策略進(jìn)行藥物代謝酶相關(guān)基因進(jìn)行變異篩查，結(jié)合臨床多中心、隨機(jī)、雙盲、對照試驗(yàn)，相信在不久的將來，我們能夠?yàn)槊恳晃恍枰寡“逯委煹幕颊哌M(jìn)行分子分型，解讀人類的基因‘天書’，并為其貼上一個‘基因標(biāo)簽’，這無疑會對個體化診療以及療效評估帶來益處。這方面，仍然需要加強(qiáng)對醫(yī)生的繼續(xù)教育，同時根據(jù)中國人的特殊基因型和基因變異頻率，制定適宜中國人群的個體化用藥方案?！?/p>

“總之，個體化醫(yī)學(xué)將是醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢。我們期待在不久的將來，‘4P醫(yī)學(xué)’將真正實(shí)現(xiàn)：預(yù)測（Predictive）、預(yù)防（Preventive）、個體化（Personalized）、參與（Participatory）?！蓖舻牢慕淌跐M懷信心地說。

我們的成就主要來自于勤奮

醫(yī)學(xué)界的很多人都明白，從現(xiàn)實(shí)的角度而言，醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究很多時候是“得不償失”的，但據(jù)記者了解，在汪道文教授的帶領(lǐng)下，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科，卻把基礎(chǔ)研究放在了科研的重要位置，并取得了實(shí)驗(yàn)室滿負(fù)荷工作，取得了平均每年發(fā)表SCI論文15篇至20篇的重要成就。作為教育部重點(diǎn)學(xué)科和國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床重點(diǎn)專科，該院的心血管內(nèi)科在醫(yī)院發(fā)展戰(zhàn)略基礎(chǔ)上，努力加強(qiáng)學(xué)科內(nèi)涵建設(shè)，矢志成為服務(wù)全省、輻射全國的強(qiáng)勢學(xué)科。

那么，他們這個科室開展基礎(chǔ)研究的情況，又有哪些經(jīng)驗(yàn)可以與大家分享？問及這一話題，汪道文教授首先介紹說，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科的基礎(chǔ)研究，主要以心腦血管病領(lǐng)域內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制為重點(diǎn)，特別在組織型激肽釋放酶（TK）、一氧化氮合酶（eNOS）心血管保護(hù)和表氧化酶-EETs代謝方面有重要突破。

汪道文教授認(rèn)為：“我們之所以能取得這些成就，主要還應(yīng)歸功于勤奮。我們實(shí)驗(yàn)室的滿負(fù)荷工作是基于24小時工作時間的基礎(chǔ)上，其研究方向由不同的實(shí)驗(yàn)小組來完成；此外，我們還有一個較好的學(xué)術(shù)研究梯隊(duì)，形成了以老帶新、傳幫帶的氛圍。每位研究生到實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，首先會被告知全年無節(jié)假日，要有充分吃苦耐勞的心理準(zhǔn)備。他們會被分到不同的小組展開實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)室會定期開展學(xué)習(xí)，匯報研究進(jìn)展，討論下一步的實(shí)驗(yàn)開展計(jì)劃，并邀請全國甚至全世界該領(lǐng)域的頂尖專家交流學(xué)習(xí)最新進(jìn)展，為實(shí)驗(yàn)工作的有序進(jìn)行打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?！?/p>

在取得這些成就的同時，他們還不遺余力地把學(xué)術(shù)交流、推廣與規(guī)范培訓(xùn)當(dāng)成另一項(xiàng)重要使命。他們在連續(xù)6年成功主辦“同濟(jì)心血管疾病高峰論壇”的基礎(chǔ)上，2014年10月10日至12日，又成功主辦了“第七屆同濟(jì)心血管疾病高峰論壇”暨“全國基因診斷與基因分型臨床應(yīng)用學(xué)習(xí)班”。對此汪道文教授介紹說：“去年的論壇邀請了全國心血管領(lǐng)域及基礎(chǔ)領(lǐng)域20多名專家授課，吸引了湖北省及周邊地區(qū)40多個縣市的醫(yī)務(wù)工作人員500余人前來參加。本次論壇分為基礎(chǔ)論壇、電生理三維演示訓(xùn)練會、臨床診療進(jìn)展和臨床病例討論4個部分。內(nèi)容涉及介入心臟病學(xué)、心臟起搏與電生理學(xué)、心力衰竭、高血壓及心腦血管疾病的基礎(chǔ)研究，尤其突出了具有同濟(jì)醫(yī)院特點(diǎn)的大血管疾病診治新技術(shù)；病例討論是本次會議的另一特點(diǎn)，吸引了廣大基層醫(yī)生的廣泛參與和熱情討論；其最大的亮點(diǎn)是新增了急危重癥專場討論部分，有極大的臨床實(shí)用性?！?/p>

篇9

【關(guān)鍵詞】 小干擾RNA; 結(jié)直腸癌; FAK; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞運(yùn)動

[Abstract] AIM: To investigate the effect of siRNA targeting FAK gene on proliferation and motility of colorectal cancer. METHODS: Recombinant plasmids that produced siRNAs targeting FAK were designed and cloned， then transfected into Caco2 cells. The changes of FAK expression levels were examined by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of FAK gene knockdown on apoptotic morphological changes， proliferation， and motility were investigated. RESULTS: Recombinant plasmids targeting FAK were successfully constructed， FAK mRNA and protein level was silenced in Caco2 cells significantly. The inhibition of mRNA level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. The ability of proliferation and motility of Caco2 cells were significantly decreased. CONCLUSION: Plasmidmediated FAK siRNA could inhibit FAK gene expression. The proliferation， motility and apoptosis were inhibited effectively， which suggested that FAK expression is closely associated with the proliferation， motility and apoptosis， etc. The results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.

[Keywords]small interfering RNA; colorectal cancer; FAK; cell proliferation; cell motility

近年來以黏附相關(guān)因子為靶點(diǎn)的治療成為基因治療研究的新策略[1]， 黏著斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞黏附介導(dǎo)的信號通路的重要因子， 作為胞內(nèi)信號蛋白酪氨酸激酶， 于1992年被獨(dú)立鑒定為Src癌基因的底物。FAK的相對分子質(zhì)量(Mr)為125 000， 定位于人染色體8q24， 與cmyc基因座接近， 此基因座在人癌細(xì)胞中往往被激活而強(qiáng)化[2]。FAK作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子， 可傳遞由胞外到胞內(nèi)的多種信號， 其在結(jié)腸癌中表達(dá)升高而在正常組織細(xì)胞中表達(dá)呈弱陽性的特點(diǎn)開始引起研究人員的關(guān)注[3]。有研究顯示， FAK基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高[4]， 并與癌細(xì)胞增殖、 侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)， 但作用機(jī)制還不明確。本實(shí)驗(yàn)將靶向FAK基因的siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入Caco2細(xì)胞， 探索FAK siRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響并初步探討其作用機(jī)制， 為結(jié)直腸癌基因治療積累實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco2購于美國ATCC。重組質(zhì)粒pU6H1GFP/FAKsiRNA為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、 百奧生物技術(shù)有限公司(南通)構(gòu)建， 大小為5.5 kb， 經(jīng)測序正確。限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ購自NEB公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、 TRIzol試劑均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Amresco公司。RT007 AMV反轉(zhuǎn)錄酶購自杭州博日科技有限公司。FAK、 GAPDH引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。針對FAK的單克隆抗體(mAb)購自Santa Cruz公司。SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Hoechst 33258購自南京凱基基因有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)及構(gòu)建 利用Ambion siRNA在線軟件設(shè)計(jì)了2條針對FAK的siRNA: siFAK1: 5′GGGCAGACGAGACCACACTGA3′; siFAK2: 5′GAAATGGAAGAAGATCAGCGCT3′; 錯義對照序列siRNASCR: 5′GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC3′。經(jīng)Blast比對證實(shí)與人其它基因無同源性后構(gòu)建合成siRNA表達(dá)載體， 雙啟動子U6和H1之間插入人FAK及錯義siRNA靶序列。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 于6孔培養(yǎng)板， 將Caco2細(xì)胞接種于無抗生素、 含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 細(xì)胞接種密度: 2×105/孔， 飽和濕度培養(yǎng)24 h。參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染優(yōu)化， 轉(zhuǎn)染后6 h更換完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為: 正常對照組(未轉(zhuǎn)染的Caco2)、 錯義siRNASCR組(非特異性siRNA轉(zhuǎn)染)、 干擾組siFAK1、 siFAK2。

1.2.3 GFP表達(dá)檢測及轉(zhuǎn)染效率評價 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞于激發(fā)波長為488 nm的熒光倒置顯微鏡下檢測GFP的表達(dá)情況。以放大100倍的視野為標(biāo)準(zhǔn)， 計(jì)5個視野表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)， 求GFP表達(dá)率: GFP表達(dá)率=發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞以2×105/孔接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中， 每組爬片4張， 轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)液， PBS洗3次， 40 g/L多聚甲醛4℃固定15 min， PBS洗3次， 吸凈液體， 每孔加入200 μL Hoeschst 33258工作液， 避光孵育10 min， PBS漂洗封片， 熒光顯微鏡下隨機(jī)選取高倍視野進(jìn)行拍照， 激發(fā)光波長為365 nm。

1.2.5 RTPCR檢測 收集轉(zhuǎn)染后24、 48、 72、 96 h細(xì)胞， 各組細(xì)胞總RNA按TRIzol試劑說明書提取。將總RNA(0.5 μg)行10 μL反轉(zhuǎn)錄體系。取cDNA再進(jìn)行25 μL PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)為: 95℃預(yù)變性2 min; 94℃變性40 s， 46℃退火40 s， 72℃延伸1 min， 共28個循環(huán)(GAPDH: 18個循環(huán))， 于72℃延伸10 min。FAK上游引物: 5′GCGTCTAATCCGACAGCA3′， 下游引物: 5′GCCGACTTCCTTCACCAT3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物為445 bp; 內(nèi)參GAPDH上游引物: 5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′， 下游引物: 5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物為580 bp。各取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物， 經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 凝膠成像儀下觀察結(jié)果及照相， BandScan 5.0進(jìn)行條帶分析， 檢測各組FAK與GAPDH的灰度比值表示FAK mRNA表達(dá)水平變化， 比值越高說明目的基因表達(dá)越高。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測 調(diào)整細(xì)胞密度為6 000個/孔， 接種至96孔板， 設(shè)Blank組(只加完全RPMI1640培養(yǎng)液)、 siRNASCR組、 正常對照組、 干擾組(siFAK1、 siFAK2)， 每組每個時間點(diǎn)設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄上清， 進(jìn)行轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體: 0.5 μL， DNA: 0.2 μg)。于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、 48、 72、 96 h后每孔加入MTT(1 g/L)15 L， 37℃、 50 mL/L CO2避光孵育5 h， 再加入100 μL DMSO振蕩10 min， 酶標(biāo)儀562 nm處測定各孔A值。生長抑制率=(1-處理組平均A值)/正常對照組平均A值×100%。

1.2.7 細(xì)胞遷移檢測 于6孔板內(nèi)按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 培養(yǎng)24 h后用外接真空泵的1 mL移液槍頭(直徑1.5 mm)垂直于6孔板板底分別打孔， PBS清洗2次， 更換完全培養(yǎng)液。分組同1.2.2， 40倍倒置顯微鏡下照相。于轉(zhuǎn)染后48、 72、 96、 120 h繼續(xù)照相， Gene Tools軟件測定每孔各時間點(diǎn)面積。遷移率=(1-該時間點(diǎn)損傷面積)/原始損傷面積×100%。

1.2.8 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 將細(xì)胞接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中(1.5×105/孔)， 每組爬片4張。設(shè)陰性對照組(PBS代替一抗)、 siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1和siFAK2共5組。轉(zhuǎn)染48 h后取蓋玻片用SP試劑盒檢測， FAK mAb稀釋度為1∶300， 避光條件下， DAB顯色， 三蒸水沖洗停顯， 梯度酒精脫水， 二甲苯透明， 取出蓋玻片置于載玻片上， 胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色為陽性染色。中性樹膠封片后， 每組隨機(jī)選取10個高倍視野(×200)， 進(jìn)行圖像采集。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以x±s表示， 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析。P

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pU6H1GFP酶切鑒定 用Omega無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒擴(kuò)增并純化質(zhì)粒， 經(jīng)Hind Ⅲ 酶切鑒定， 可見質(zhì)?？杀磺懈畛纱蠹s5.5 kb的線性片段， 結(jié)果完全正確(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染效率 經(jīng)優(yōu)化的脂質(zhì)體條件轉(zhuǎn)染后， GFP表達(dá)率為(44.59±2.71)%。

2.3 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)Hoechst 33258染色可見正常對照組細(xì)胞染色質(zhì)為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光， 無明顯凋亡特征(圖2A); 經(jīng)siFAK1和siFAK2組轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后， 細(xì)胞表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化， 胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)、 斷裂成塊、 呈顆粒狀亮藍(lán)色熒光， 且有少量凋亡小體出現(xiàn)(圖2D、 E中箭頭所示)。脂質(zhì)體組及siRNASCR組均沒有出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變(圖2B、 C)。因此可得出脂質(zhì)體試劑及pU6H1GFP載體對轉(zhuǎn)染無明顯影響， 排除假陽性的干擾。

2.4 FAK mRNA表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞于24、 48、 72、 96 h后檢測siRNA敲低FAK mRNA水平表達(dá)的時間效應(yīng)關(guān)系， 并確定敲低效果最好的1條序列。RTPCR結(jié)果顯示， 各組內(nèi)相應(yīng)內(nèi)參GAPDH的條帶基本一致， siFAK1和siFAK2組FAK mRNA水平低于正常組和siRNASCR組， 且敲低效應(yīng)在轉(zhuǎn)染后24～48 h范圍內(nèi)呈時間依賴性降低， 至48 h降到最低(P

2.5 細(xì)胞增殖狀況 MTT法檢測表明， siFAK1和siFAK2組細(xì)胞增殖抑制率明顯增加(圖4)。與正常對照組相比， siFAK1和siFAK2對細(xì)胞增殖的抑制率在轉(zhuǎn)染后24～72 h均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.6 細(xì)胞遷移狀況 與正常組相比， 特異性siFAK1、 siFAK2組使Caco2細(xì)胞的遷移率明顯降低(P

2.7 FAK蛋白表達(dá)變化 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示， 正常組FAK表達(dá)多位于胞質(zhì)， 呈棕褐色， 強(qiáng)陽性表達(dá)， 而siFAK1、 siFAK2組細(xì)胞中FAK蛋白的表達(dá)明顯減弱(圖6)。ImagePro Plus 6.0圖像分析各組的A值， 轉(zhuǎn)染后48 h siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1及siFAK2光密度分析結(jié)果分別為0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008。可見轉(zhuǎn)染后48 h兩個干擾組的蛋白表達(dá)明顯被抑制(P

3 討論

FAK作為Src癌基因的底物， 位于整合素富集的黏著斑處， 與多種信號分子相互作用， 介導(dǎo)多種細(xì)胞表面受體激活及信號傳輸來調(diào)控細(xì)胞骨架組建、 細(xì)胞增殖、 凋亡及存活、 細(xì)胞轉(zhuǎn)移及入侵等， 最終參與腫瘤的發(fā)生。有研究表明， 在正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中FAK表達(dá)呈弱陽性或陰性[5]， 這與維持上皮細(xì)胞的生理功能是不可缺少的; 而在結(jié)直腸癌相關(guān)的細(xì)胞中FAK表達(dá)明顯升高， 說明其表達(dá)上調(diào)可能是結(jié)直腸癌具有惡性表型的早期事件。因此， FAK作為腫瘤發(fā)生進(jìn)程相關(guān)的關(guān)鍵分子可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)， 而抑制FAK的表達(dá)則有望成為腫瘤基因治療的新熱點(diǎn)。針對FAK基因的反義寡核苷酸治療結(jié)直腸癌的研究已有報道[6]。RNAi是近年來快速發(fā)展的一種高效的基因沉默技術(shù)， 并作為一種關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用于抗腫瘤、 基因功能研究[7]。

本實(shí)驗(yàn)以Caco2細(xì)胞為研究對象， 采用針對FAK mRNA的特異性siRNA重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。RTPCR顯示， 所設(shè)計(jì)的兩個siFAK重組質(zhì)粒均能使其mRNA水平下降， 其中以siFAK1干擾效果更強(qiáng)， 在轉(zhuǎn)染后48 h敲低效果最明顯， 說明siRNA對FAK的抑制作用可能有時相性。而錯義組則沒有上述作用， 從而另一方面證明RNA干擾的特異性。同時免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染后48 h siFAK1對細(xì)胞FAK蛋白抑制更明顯。

細(xì)胞增殖和遷移在多種惡性腫瘤的病理生理過程中起重要作用。有研究表明[8]， 活化的FAKRASMAPK是促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖的重要信號通路。本研究中， 細(xì)胞增殖及遷移實(shí)驗(yàn)表明， 靶向FAK基因干擾Caco2細(xì)胞后， 細(xì)胞貼壁能力降低， 變圓易脫落， 細(xì)胞的增殖及遷移明顯受抑， 因此我們推測FAK基因表達(dá)受抑可使FAKRASMAPK信號通路受阻， 最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖及遷移能力降低， 提示FAK基因可能是結(jié)直腸癌腫瘤治療的一個新靶點(diǎn)。相反siRNASCR組對細(xì)胞的增殖及遷移無明顯影響， 因此可以斷定質(zhì)粒載體pU6H1GFP可以作為安全有效的基因載體。近年來有關(guān)研究表明FAK與腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)FAK通過活化PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信號存活通路而引發(fā)NFκB活化， 最終阻斷caspase3級聯(lián)反應(yīng)， 使細(xì)胞凋亡受抑。因此FAK的表達(dá)與凋亡密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)初步研究結(jié)果顯示， 通過Hoechst熒光染色發(fā)現(xiàn)siFAK轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞48 h后細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化: 核致密濃縮， 染色體斷裂， 并出現(xiàn)凋亡小體等特征。從分子機(jī)制來說， FAKsiRNA可能通過下調(diào)FAK mRNA和蛋白表達(dá)水平而促使Caco2細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)中2個siFAK重組質(zhì)粒對靶基因的抑制效應(yīng)不同， 其中以siFAK1抑制FAK基因mRNA、 增殖及遷移的作用最為明顯， 這種針對同一基因的不同靶點(diǎn)而產(chǎn)生的不同干擾效果， 可能與位置效應(yīng)有關(guān)[10]。因此說明利用RNA干擾進(jìn)行腫瘤臨床治療要對干擾序列進(jìn)行篩選。

綜上所述， FAK與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展密切相關(guān)， 我們的初步研究結(jié)果表明， 干擾FAK基因表達(dá)后使Caco2細(xì)胞增殖、 遷移力明顯減緩、 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡等現(xiàn)象， 且FAK基因表達(dá)受抑后胞質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)受損， 其機(jī)制可能與抑制Caco2細(xì)胞FAK mRNA和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。因此靶向抑制FAK基因的表達(dá)， 可能是結(jié)直腸癌治療的有效途徑。此研究為RNAi在腫瘤治療方面奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)， 也為臨床研究和進(jìn)一步的治療研發(fā)提供了更多的依據(jù)。

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篇10

1 腫瘤MDR產(chǎn)生的機(jī)制

MDR的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生的多種途徑綜合作用的結(jié)果，其形成機(jī)制非常復(fù)雜，其產(chǎn)生機(jī)制如下。

1.1 膜糖蛋白介導(dǎo)的MDR

1.1.1 P糖蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典MDR P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）是由多藥耐藥基因MDR1編碼的一種分子量為170kD的跨膜糖蛋白，它屬于典型的ABC(ATPbinding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員[2]。Pgp是一個ATP依賴性的藥物外排泵，能利用ATP水解釋放的能量主動將疏水親脂性化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低于殺傷濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR[3]。

1.1.2 多藥耐藥相關(guān)蛋白介導(dǎo)的MDR 多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）是由1531個氨基酸組成的分子量為190kD的跨膜糖蛋白[4]。它與Pgp有某種程度上的序列同源性，同屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。MRP可通過促進(jìn)谷胱甘肽結(jié)合藥物從細(xì)胞內(nèi)的排出而產(chǎn)生MDR[5]。

1.1.3 乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的MDR 乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是由655個氨基酸組成的分子量為72.6kD的跨膜蛋白，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由一個疏水跨膜區(qū)和一個核苷酸結(jié)合區(qū)構(gòu)成。兩個BCRP分子通過二硫間形成同源或異源二聚體后才具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性[6]。BCRP可以降低阿霉素、柔紅霉素等在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累從而產(chǎn)生耐藥性[7]。

1.1.4 肺耐藥相關(guān)蛋白介導(dǎo)的MDR 肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistancerelated protein，LRP）是一種分子量為110kD的蛋白質(zhì)。LRP與Pgp、MRP、BCRP的作用機(jī)制不同，它主要通過核靶點(diǎn)屏蔽機(jī)制引起MDR，LRP可以使以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物不能通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，有些藥物即使進(jìn)入核內(nèi)也會很快被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中[8]。

1.2 酶介導(dǎo)的MDR

1.2.1 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的MDR 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathionestransferase，GST) 是一組與細(xì)胞解毒功能有關(guān)的酶，分為α、μ和π等多種同工酶，各由GST 超基因家族的相應(yīng)基因編碼。GST 通過催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)與藥物結(jié)合，使兩者形成復(fù)合物而解毒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。GST本身也可與親脂性藥物結(jié)合增加其水溶性，促進(jìn)外排而降低化療藥物的細(xì)胞毒作用，同樣也引起腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。烷化劑和鉑類藥物均可通過這一途徑解毒。

1.2.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)的MDR 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomerase，TopoⅡ）是存在于細(xì)胞核內(nèi)催化DNA雙鏈拓?fù)洚悩?gòu)體相互轉(zhuǎn)換的基本核酶[9]，可改變DNA 的拓?fù)湫问?，參與DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等許多重要活動。研究表明，TopoⅡ介導(dǎo)的MDR表纖維耐藥細(xì)胞酶轉(zhuǎn)錄水平和活性降低，同時，TopoⅡ還可以參與特殊耐藥基因的調(diào)控，合成出具有特殊排泵功能的膜蛋白，將藥物泵出胞外，從而產(chǎn)生耐藥。一般說來，TopoⅡ異常所致的MDR有以下特點(diǎn)：①對許多天然藥物呈現(xiàn)抗藥性；②膜活性藥物不能提高抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用；③藥物在細(xì)胞內(nèi)聚積與外排無變化；④MDR1與Pgp表達(dá)未增加；⑤TopoⅡ含量及活性均有所下降。

1.2.3 蛋白激酶C介導(dǎo)的MDR 蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)是由一個超基因家族編碼同源性很高的相關(guān)分子組成的一組酶，在MDR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PKC幾乎參與所有MDR機(jī)制的調(diào)節(jié)[10，11]。Pgp是PKC 催化磷酸化的底物，Pgp 磷酸化后可被激活，使其藥物外排功能增強(qiáng)。另外，PKC 也可使MRP、LRP、GST 和Topo II 磷酸化，分別增強(qiáng)它們的活性。

1.3 凋亡調(diào)控基因介導(dǎo)的MDR

多數(shù)化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡(PCD) 即凋亡來達(dá)到治療目的，反之，腫瘤細(xì)胞也可通過逃逸凋亡或拮抗凋亡獲得生存，即產(chǎn)生多藥耐藥。目前研究比較多的是bcl2基因和p53基因。

1.3.1 bcl2基因 bcl2是最重要的細(xì)胞凋亡抑制基因，它位于18號染色體上（18q21）。bcl2基因過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的生存，同時也抑制放射線、化療藥物等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。bcl2基因轉(zhuǎn)染bcl2低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞bcl2表達(dá)增強(qiáng)，對大多數(shù)細(xì)胞毒藥物產(chǎn)生耐受[12，13]。用針對bcl2 mRNA的反義寡核苷酸處理多發(fā)性骨髓瘤患者的惡性漿細(xì)胞，bcl2蛋白表達(dá)量減少，并伴有凋亡增加和對化療藥物的敏感性增加[14]。臨床上許多白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞中bcl2基因的表達(dá)較高者，往往同時伴有放、化療耐受。

1.3.2 p53基因 p53基因有野生型和突變型兩種存在形式。野生型p53被視為細(xì)胞生長的“監(jiān)控器”，能誘導(dǎo)DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)入G1/S期，抑制細(xì)胞增殖直至損傷DNA得到修復(fù)，若修復(fù)失敗則誘導(dǎo)損傷細(xì)胞凋亡。當(dāng)p53基因發(fā)生突變、缺失導(dǎo)致表達(dá)異常時（突變型p53），其對凋亡的控制也會發(fā)生異常，這時化療藥物所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受顯著增強(qiáng)。同時基因的突變也可能特異性激活MDR1/Pgp啟動子使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR。

其他參與凋亡調(diào)控的基因如cmyc、ras、fas/apo1、bcr/abl、cerB2/neu等也與腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

1.4 DNA異常修復(fù)引起的MDR

DNA是傳統(tǒng)的化療藥物烷化劑和鉑類化合物的作用靶點(diǎn)，它們通過直接破壞DNA結(jié)構(gòu)的完整性引起DNA損傷而殺傷腫瘤細(xì)胞。這種DNA損傷的異常修復(fù)會使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。涉及以下機(jī)制：(1)腫瘤細(xì)胞DNA鳥嘌呤堿基第6位氧原子烷基化導(dǎo)致細(xì)胞突變死亡是烷化劑的重要?dú)麢C(jī)制。O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(06methylguanine DNA ethyltransferaes，MGMT)可將DNA中O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移至酶自身的半胱氨酸殘基上，通過修復(fù)烷化劑對細(xì)胞DNA的損傷使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。(2)核苷酸切割修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)是一種復(fù)雜的修復(fù)機(jī)制，能切除2729個堿基長度的DNA損害，理論上NER能切除任何使DNA雙螺旋產(chǎn)生較大變化的DNA損傷。(3)錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)能識別結(jié)構(gòu)正常的非配對堿基間錯配的微小改變。MMR系統(tǒng)缺陷使細(xì)胞識別DNA損傷的能力減弱，而不產(chǎn)生引起細(xì)胞凋亡的信號。MMR功能喪失導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加，產(chǎn)生對抗癌藥耐受的突變體。

2 腫瘤MDR的逆轉(zhuǎn)策略

隨著腫瘤細(xì)胞MDR分子基礎(chǔ)和發(fā)生機(jī)制研究的不斷深入，用不同手段和方法來克服腫瘤細(xì)胞的MDR已在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用方面有了很大進(jìn)展。目前常采用以下幾種逆轉(zhuǎn)策略。

2.1 化學(xué)藥物治療

針對腫瘤MDR的產(chǎn)生過程，應(yīng)用多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑是解決腫瘤MDR的主要手段。經(jīng)過二十多年的開發(fā)研究，已發(fā)現(xiàn)大量具有MDR逆轉(zhuǎn)活性的化合物，主要包括：鈣通道阻滯劑(維拉帕米及其衍生物)、鈣調(diào)蛋白抑制劑(噻吩嗪類化合物)、免疫抑制劑(環(huán)孢菌素A 及其衍生物)、類固醇和激素類似物(黃體酮、甲地孕酮) 等。但這類逆轉(zhuǎn)劑的毒副作用也使其臨床應(yīng)用受到限制。

2.2 天然藥物（中藥）治療

天然藥物具有低毒、資源豐富、作用靶點(diǎn)多等特點(diǎn)。近年來許多學(xué)者把目光轉(zhuǎn)向天然藥物或中藥，探索天然的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑。研究證實(shí)有多種植物中藥具有逆轉(zhuǎn)MDR的作用，且逆轉(zhuǎn)方式各有特點(diǎn)。

中藥川芎嗪可下調(diào)MRP陽性表達(dá)率，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度升高而逆轉(zhuǎn)MDR[15]。人參皂甙可下調(diào)mdr1mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致其產(chǎn)物Pgp減少，從而使抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積增加[16]。漢防己甲素（TTD）不僅能明顯提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，且能明顯增強(qiáng)化療藥物致細(xì)胞凋亡的作用[17]。千金藤素（CEP）通過降低NF κB活性，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)MDR[18]。漏蘆抽提劑RHU通過促進(jìn)耐藥細(xì)胞株凋亡，抑制腫瘤耐藥基因MDR/ Pgp的表達(dá)從而顯著逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[19]。 冬凌草甲素可明顯誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡，顯著地逆轉(zhuǎn)K256/ A02 細(xì)胞對柔紅霉素、高三尖杉酯堿的耐藥性[20]。蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿可競爭性地與Pgp結(jié)合，阻斷化療藥物外排而增強(qiáng)VCR對BEL7402細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[21]。浙貝母堿能直接抑制糖蛋白的表達(dá)，明顯提高由Pgp或MRP介導(dǎo)的耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物濃度[22]。茶多酚能明顯增加MCF7 /ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性，且其耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能是Pgp[23]。槲皮素能夠下調(diào)MCF7/ADM細(xì)胞Pgp的表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)MCF7/ADM細(xì)胞的MDR [24]。鴉膽子油乳通過競爭Pgp 對其他化療藥物的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制藥物泵出，在一定程度上逆轉(zhuǎn)K562/A02，MCF27/ADM，KB/VCR等細(xì)胞的耐藥性[25]。甲基蓮心堿可抑制Pgp 的功能和表達(dá)，減少藥物的外排從而克服MDR細(xì)胞的凋亡抗性[2627] 。葡萄籽多酚可能通過抑制Pgp 的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡而在體內(nèi)、體外逆轉(zhuǎn)MCF7/ ADM細(xì)胞的耐藥性[2829]。欖香烯可下調(diào)抗凋亡基因bcl2的表達(dá)，促使耐藥細(xì)胞凋亡[30]。

目前中藥逆轉(zhuǎn)劑的研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，而對于其在體內(nèi)的作用效果及安全性仍有待進(jìn)一步的在體研究來驗(yàn)證。這在一定程度上也阻礙了中藥在逆轉(zhuǎn)MDR方面前進(jìn)的步伐及其在臨床的應(yīng)用。

2.3 基因治療

基因治療是腫瘤治療的新方法，MDR的基因治療研究主要集中在MDR1 基因及某些癌相關(guān)基因。反義核酸技術(shù)、核酶技術(shù)及RNA干擾技術(shù)給耐藥逆轉(zhuǎn)提供了新的高效特異性的方法，較傳統(tǒng)的MDR 逆轉(zhuǎn)方法有較多優(yōu)勢。

2.3.1 反義寡核苷酸技術(shù) 反義寡核苷酸技術(shù)(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)是指用一段人工合成的能與RNA或DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸鏈來抑制基因的表達(dá)。應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)治療MDR就是用一段人工合成的能與耐藥相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上相結(jié)合的核苷酸來封閉多藥耐藥基因轉(zhuǎn)錄，從而改變其MDR 特性。

將MDR1基因的ASODN 導(dǎo)入表達(dá)MDR1基因的耐藥細(xì)胞后都可明顯下調(diào)Pgp的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度[31]。將ASODN的3'端與阿霉素共價連接后作用于KBA1細(xì)胞，可使KBA1細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度比單用阿霉素組高6.4倍，比單用ASODN組高1.8倍[32]。應(yīng)用MRP ASODN可下調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF7/VP中MRP mRNA 表達(dá)[33]。多細(xì)胞卵巢癌球狀體有高水平P27和Pgp表達(dá)，而且其對紫杉醇的耐藥性較單層卵巢癌細(xì)胞更強(qiáng)。應(yīng)用ASODN技術(shù)可以下調(diào)多細(xì)胞卵巢癌球狀體中P27和Pgp表達(dá)，從而增強(qiáng)其對紫杉醇的敏感性[34]。當(dāng)然，反義寡核苷酸較短的半衰期及較高的制備成本也使其廣泛應(yīng)用受到一定限制。

2.3.2 反義RNA技術(shù) 反義RNA技術(shù)指利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建人工表達(dá)載體，使其體外或體內(nèi)表達(dá)反義RNA，從而抑制靶基因的表達(dá)。反義RNA是與多藥耐藥相關(guān)基因的mRNA形成二聚體而抑制mRNA翻譯，從而逆轉(zhuǎn)MDR。陳琳等[35] 應(yīng)用自行構(gòu)建的攜帶反義MRP的重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染人肝癌耐藥細(xì)胞SMMC7721/ADM，使ADM、DNR對SMMC7721/ADM細(xì)胞的IC50分別為0.487μg/ml、0.328μg/ml，RF值分別為97.4、109.3，轉(zhuǎn)染后24h，MRP mRNA水平開始下降并呈持續(xù)下降趨勢，48h后伴有MRP蛋白表達(dá)的持續(xù)下降。表明MRP反義RNA可有效封閉MRP基因表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細(xì)胞的MDR。陳綱等[36] 研究發(fā)現(xiàn)草酸鉑、5Fu聯(lián)合MDR1反義RNA對直腸癌耐藥細(xì)胞有協(xié)同殺傷作用，可望成為治療對5Fu耐藥的直腸癌的有效方法。還有研究顯示，MDR1反義RNA能下調(diào)人肝癌耐藥細(xì)胞SMMC7721/ADM中MDR1 mRNA和Pgp表達(dá)，使阿霉素和柔紅霉素對SMMC7721/ADM細(xì)胞的IC50分別下降了31.25%和62.96%[37]。反義RNA技術(shù)能夠提高化療藥物的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR。

2.3.3 核酶技術(shù) 核酶是一類具有催化活性的RNA分子，它能特異性地識別mRNA中的GUC序列，并催化RNA的剪切反應(yīng)，而其自身不被消耗可重復(fù)使用，具有高效率、高特異性、少副作用等特點(diǎn)。

特異性切割bcl2 mRNA 的核酶可有效地阻斷bcl2 蛋白合成，明顯促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高紫杉醇化療效果，克服耐藥[38]。Kowalski等[39]用具有催化活性的抗BCRP的核酶處理257RNOV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)257RNOVRzB1中BCRP mRNA 水平顯著降低，米托蒽醌I(xiàn)C50 ( the 50% inhibitory concentration) 值也明顯降低。王海等[40]利用核酶技術(shù)切割腫瘤多藥耐藥基因(MDR1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗MDR1核酶處理的人肝癌耐藥細(xì)胞株Hep G2 MDR1 mRNA、Pgp明顯降低，細(xì)胞內(nèi)羅丹明聚集，對阿霉素的敏感性提高200倍。針對MDR1mRNA的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的核酶（RZ135和RZ106）能夠下調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞中MDR1mRNA和Pgp的表達(dá)，抑制Pgp的外排功能[41]。

2.3.4 RNA干擾技術(shù) RNA干擾(RNA interference，RNAi)是含21～23個核苷酸的小分子干擾RNA 片段(small interference RNAs，siRNA) 特異性地識別并降解其同源基因mRNA，誘導(dǎo)序列特異性基因沉默的過程?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用到基因功能、基因表達(dá)調(diào)控等熱門領(lǐng)域，為基因治療開辟了新的途徑。

張曉菁等[42]用脂質(zhì)體介導(dǎo)將MDR1特異性siRNA的表達(dá)載體(pSN/ mdr1a 和pSN/ mdr1b) 轉(zhuǎn)染阿霉素耐藥細(xì)胞株OVCAR/ AR和多藥耐藥亞株OVCAR/MDR細(xì)胞，可顯著抑制兩株耐藥細(xì)胞MDR1 mRNA 和Pgp的表達(dá)，OVCAR/MDR 和OVCAR/AR 細(xì)胞對阿霉素抗藥性的逆轉(zhuǎn)率分別為79.5%和93.9%。表明載體表達(dá)的MDR1特異性siRNA可抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞MDR1基因的表達(dá)，增加耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性。轉(zhuǎn)錄相關(guān)鋅帶蛋白基因(zinc ribbon domaincontaining 1 protein，ZNRD1) 可能通過類似轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用參與腫瘤多藥耐藥[43]，樸瑛等[44]構(gòu)建了ZNRD1 基因的siRNA 載體并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入HL60/VCR細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞對長春新堿和阿霉素的敏感性增強(qiáng)，且低表達(dá)Pgp 和bcl2 ，該siRNA真核表達(dá)載體在一定程度上逆轉(zhuǎn)了白血病細(xì)胞的耐藥性?？笰BCG2的siRNA和短發(fā)夾RNA可完全抑制ABCG2 mRNA及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，而且抗ABCG2的短發(fā)夾RNA使耐藥細(xì)胞中化療藥物濃度累積到親代敏感細(xì)胞水平[45]。與傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)相比，RNAi設(shè)計(jì)更簡便、作用更迅速、效果更明顯。

3 展望

腫瘤多藥耐藥的問題仍然是目前臨床治療所面臨的主要困難之一，對其進(jìn)行全面深入的研究將有助于惡性腫瘤的治療。臨床逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)的根本性突破，還有待于MDR機(jī)制的進(jìn)一步明確。隨著高效低毒逆轉(zhuǎn)劑的不斷發(fā)現(xiàn)以及基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展并逐漸應(yīng)用于臨床，腫瘤對化療藥物的耐藥性將會被克服。

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篇11

一、福建省血液病專業(yè)和福建省醫(yī)學(xué)會血液病學(xué)分會的發(fā)展史

福建省醫(yī)學(xué)會血液病學(xué)分會是福建省血液病臨床和實(shí)驗(yàn)研究工作者的群眾性學(xué)術(shù)團(tuán)體。我省血液病學(xué)專業(yè)早在五十年代就在當(dāng)時的福建醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院開展，是全國較早開展血液病學(xué)研究的省份之一，當(dāng)時臨床研究主要是常見血液病、白血病和淋巴瘤的治療?；A(chǔ)研究“紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉”的研究曾獲1978年全國醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)大會成果獎。1978年我省的“三尖杉酯堿治療白血病的研究”獲全國科技大會成果獎。同年福建省血液病研究室成立，掛靠在當(dāng)時的福建省人民醫(yī)院和三明地區(qū)第一醫(yī)院。研究室于1988年7月經(jīng)省編制委員會批準(zhǔn)，擴(kuò)大升為福建省血液病研究所。

1987年10月在龍巖市召開福建省第四次血液病學(xué)術(shù)會議，成立了福建省醫(yī)學(xué)會血液病學(xué)分會，并已分別于1991年、1998年、2004年進(jìn)行換屆改選，歷任主任委員為：葉德富、黃淑樺、陳元仲、胡建達(dá)，呂聯(lián)煌教授為名譽(yù)主任委員。分會創(chuàng)建以來，400篇以上，主編和參編20多部專著、教材和參考書。有70項(xiàng)左右科研及教學(xué)成果獲國家、部省及省廳級科技成果獎，其中國家級科技成果獎3項(xiàng)。目前分會共有45名委員。

分會掛靠單位為福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院、福建省血液病研究所，研究所是一所集醫(yī)療、教學(xué)、科研于一體的應(yīng)用型研究所，是福建醫(yī)科大學(xué)內(nèi)科學(xué)（血液病學(xué)）博士點(diǎn)和重點(diǎn)學(xué)科，臨床醫(yī)學(xué)博士后科研流動站，福建省高等院校"211工程"重點(diǎn)學(xué)科，福建省科技廳的優(yōu)先發(fā)展研究所，福建省教育廳和福建省衛(wèi)生廳的重點(diǎn)學(xué)科，又是國家藥品臨床研究基地。目前全所有醫(yī)、護(hù)、技等專業(yè)技術(shù)人員75人，其中，教授7人，國家級專家3人，博士生導(dǎo)師4人，碩士生導(dǎo)師8人，有博士學(xué)位9人，碩士學(xué)位11人。研究所所長是呂聯(lián)煌教授。

研究所分臨床病房、臨床血液實(shí)驗(yàn)室和基因工程實(shí)驗(yàn)室等三部分。臨床部分為協(xié)和醫(yī)院第十二、十三兩個病區(qū)，共有病床109張，包括骨髓移植病床6張，還有全日制血液病?？崎T診。臨床血液實(shí)驗(yàn)室有血細(xì)胞形態(tài)室、血液生化室、止血血栓室、流式細(xì)胞室等4個實(shí)驗(yàn)室?；蚬こ虒?shí)驗(yàn)室有基因診斷室、基因測序室、DNA/RNA合成室、核酸純化室、變性高效液相色譜室、細(xì)胞庫、無菌級動物實(shí)驗(yàn)室等。研究所是全省血液病的診療和教學(xué)科研中心，為來自省內(nèi)、外的白血病、惡性淋巴瘤、貧血、出血及其他血液病病人提供醫(yī)療服務(wù)，并為省內(nèi)、外醫(yī)院培養(yǎng)血液病專業(yè)技術(shù)人才。

目前研究所的主要研究方向有：⑴血液病診療規(guī)范化及個體化研究；⑵血液腫瘤的轉(zhuǎn)錄基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因治療研究；⑶細(xì)胞因子與造血調(diào)控的研究；⑷植物有效成份抗白血病活性的研究；⑸造血干細(xì)胞移植的基礎(chǔ)和臨床研究。

除福建省血液病研究所外，我省部分地市級醫(yī)院也成立血液病研究機(jī)構(gòu)，如三明市血液病研究所，泉州市第一醫(yī)院血液病研究室，漳州市立醫(yī)院血液病研究室等。目前各地市級以上醫(yī)院均有血液病?？漆t(yī)生和專業(yè)病床，部分縣級醫(yī)院有血液病專科醫(yī)生。泉州市還成立了泉州市醫(yī)學(xué)會下的血液病專業(yè)委員會。

二、近年來福建省血液病學(xué)學(xué)科進(jìn)展

下面就我省血液病學(xué)科的臨床與基礎(chǔ)研究進(jìn)展概述如下:

(一)臨床研究

1.真性紅細(xì)胞增多癥

真性紅細(xì)胞增多癥是一種骨髓增殖性疾病，傳統(tǒng)治療方法主要有化療和放射治療，副作用大。由呂聯(lián)煌教授主持下應(yīng)用三尖杉酯堿治療真性紅細(xì)胞增多癥，有很好的療效。五項(xiàng)指標(biāo)（完全緩解率、達(dá)完全緩解中數(shù)時間，完全緩解持續(xù)時間、復(fù)發(fā)率、復(fù)發(fā)時間）全面對比，這種新療法優(yōu)于目前國內(nèi)外治療該病的其他療法，具有療效好、見效快、價格廉、副作用小、不誘發(fā)白血病等優(yōu)點(diǎn)，是國際首創(chuàng)的，較理想的一種新療法。研究論著在中華內(nèi)科雜志發(fā)表[1]，受到國內(nèi)外同行專家的重視。法國醫(yī)學(xué)雜志轉(zhuǎn)載論文摘要，法國、美國等外國專家來信索取研究資料，美國醫(yī)生來信聯(lián)系有真性紅細(xì)胞增多癥病人因治療效果不佳，希望來中國住我院采用三尖杉酯堿治療。本研究成果已在國內(nèi)推廣應(yīng)用，許多醫(yī)療單位應(yīng)用后同樣取得很好的療效，獲得明顯的社會效益和一定的經(jīng)濟(jì)效益。該成果榮獲1987年國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎。

2.再生障礙性貧血（AA）

再生障礙性貧血是造血系統(tǒng)“重癥”之一，近年，國內(nèi)、國外學(xué)者對AA的認(rèn)識較傳統(tǒng)觀念有了明顯進(jìn)步,眾多研究表明細(xì)胞免疫異常是AA發(fā)病機(jī)制中的主要環(huán)節(jié)。免疫抑制治療是AA的主要治療方法。該類治療主要包括抗淋巴細(xì)胞球蛋白/抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ALG/ATG)、環(huán)孢霉素（CSA）、腎上腺皮質(zhì)激素類、大劑量靜脈人血丙種球蛋白、環(huán)磷酰胺及異基因骨髓移植前的預(yù)處理等。我省自上世紀(jì)九十年代將ATG/ALG用于治療SAA，現(xiàn)已成為AA（特別是SAA）主要的免疫治療手段。該類制劑治療AA的機(jī)制主要是抑制或破壞T淋巴細(xì)胞。ATG/ALG多不單用，可與CSA、雄激素、造血刺激因子合用。聯(lián)合方案有效率可高達(dá)50--60%左右，并有取代干細(xì)胞移植趨勢。

CSA是用于AA的另一種免疫抑制劑。CSA與ATG/ALG在AA治療上有互補(bǔ)作用，故聯(lián)用效佳。單用CSA加雄激素合用治療AA也有相當(dāng)?shù)寞熜?，但起效慢?/p>

除上述藥物治療外，我們也開展異基因造血干細(xì)胞移植治療AA，一些病人獲得痊愈，但開展例數(shù)尚少。

3.急性白血?。ˋL）

白血病病因仍不明確。對白血病病因?qū)W的研究，我省的呂聯(lián)煌教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組首次發(fā)現(xiàn)我國有人類T細(xì)胞白血病病毒流行區(qū)及其傳染方式[2]，為防止這種致命的白血病病毒流行在全國蔓延擴(kuò)大做出了貢獻(xiàn)，基因測序研究首次發(fā)現(xiàn)我國HTLV-1與國外報導(dǎo)不同，這一發(fā)現(xiàn)對了解HTLV-1感染源有重大意義，并有助于了解世界HTLV-1流行及分布特點(diǎn)，成果獲1997年國家科技進(jìn)步獎三等獎及1998年萍科技獎二等獎。

由于白血病細(xì)胞起源、分化和生物學(xué)行為不同，構(gòu)成了白血病的異質(zhì)性，因此急性白血病的全面、正確分型是準(zhǔn)確、及時治療的前提。隨著免疫學(xué)與生物學(xué)的進(jìn)展及應(yīng)用，急性白血病的診斷技術(shù)也有很大發(fā)展，國際血液病學(xué)家及血液病理學(xué)家于2001年3月在里昂會議上建議造血和淋巴組織腫瘤的WHO分類法，就是應(yīng)用MICM方法力求反映疾病本質(zhì)，成為國際上一種新的分類標(biāo)準(zhǔn)[3]。

為了與國際接軌,近年來省內(nèi)也漸開展MICM分型方法,但目前尚待進(jìn)一步完善中,已開展白血病融合基因檢測,用于臨床診斷。

急性髓細(xì)胞白血病(AML)治療主要是聯(lián)合化療、誘導(dǎo)分化、造血干細(xì)胞移植、免疫化療、基因靶向治療等。我們在臨床上對AML誘導(dǎo)治療一般采用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案DA（3+7）或IA（3+7），≤60歲AML患者，CR可達(dá)75%～80%，OS約為30%;≥60歲AML CR率為40%～55%，OS為10%～15%,接近國際先進(jìn)水平。為了提高CR率，我們也進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究,如蒽環(huán)類藥增量，加大阿糖胞苷量，或加用其他化療藥物如VP-16、VM26、氟達(dá)拉賓、拓?fù)涮婵档?，同時還可用預(yù)激方法（G-CSF、GM-CSF）促使白血病細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期等。 緩解后化療對＜60歲的AML患者有明顯療效。對于中?；颊呖捎?～4個大劑量阿糖胞苷后進(jìn)行異基因干細(xì)胞移植。對于高危AML患者在CR后應(yīng)立即進(jìn)行異基因干細(xì)胞移植。

急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）是AML中的一種亞型，臨床以出凝血異常導(dǎo)致的出血為特征，血象常表現(xiàn)為白細(xì)胞不高，骨髓中顆粒增多的異常早幼粒細(xì)胞增多，細(xì)胞遺傳學(xué)檢查有特異性改變，分子生物學(xué)可以檢測到早幼粒細(xì)胞白血病-維甲酸受體a（PML-RARa）融合基因。近十多年來對APL的研究取得較大進(jìn)展，隨著從臨床到基礎(chǔ)、從基礎(chǔ)到臨床的不斷反復(fù)，化療、維甲酸、砷劑、新研發(fā)的分子靶向性藥物成為APL治療的4個里程碑，使得APL成為僅通過藥物即可能達(dá)到治愈的惡性血液病，同時分化誘導(dǎo)治療的成功也為其他腫瘤提供了一條新的思路[4]。在臨床上我們常規(guī)使用ATRA聯(lián)合亞砷酸治療APL，CR率大于90%，與國內(nèi)外先進(jìn)水平相仿。

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是一組生物學(xué)和預(yù)后不同的異質(zhì)性疾病。近年來在分子生物學(xué)上的進(jìn)展為臨床上根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)特征更為準(zhǔn)確地識別預(yù)后不同的ALL，并根據(jù)其危險度調(diào)整治療策略，使治療更加個體化和高效低毒。

我省成人ALL最常用的誘導(dǎo)緩解方案包括長春新堿、潑尼松、蒽環(huán)類、L-門冬酰胺酶和環(huán)磷酰胺(CTX)等。CR率達(dá)到80%～85%,中位緩解時間約為18個月,用地塞米松(DX)替代潑尼松,表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗白血病活性和腦脊液中更高的藥物水平。上述聯(lián)合用藥方案已經(jīng)能夠獲得相當(dāng)高的緩解率,但強(qiáng)烈的誘導(dǎo)緩解可能會對疾病緩解時間和長期生存產(chǎn)生積極的影響，如在T-ALL加用Ara-C和CTX,在成熟B-ALL分次應(yīng)用CTX和用大劑量甲氨喋呤(MTX)等。

鞏固治療包括改良的誘導(dǎo)緩解方案,序貫的鞏固治療方案和造血干細(xì)胞移植。目前的治療策略傾向于根據(jù)亞型和疾病危險分組調(diào)整鞏固治療方案，我們也參考國外強(qiáng)烈的化療方案HyperCVAD，分次給予CTX、大劑量Ara-C和MTX。

HLA匹配的相關(guān)供者的干細(xì)胞移植（SCT）已經(jīng)被應(yīng)用于治療各種類型的成人ALL。在CR1后用HLA相配的異基因SCT治療的生存率約為50%。

Ph+ALL發(fā)生率與年齡顯著相關(guān)，在ALL中總的發(fā)生率為20%～30%，隨年齡增長發(fā)生率增高，盡管60%的病例能獲得CR，但大多數(shù)病例會復(fù)發(fā)，其5年的DFS低于10%～20%。伊馬替尼是一種選擇性bcr-abl酪氨酸激酶抑制劑，用于治療Ph+ALL顯示出良好的應(yīng)用前景。我們應(yīng)用伊馬替尼治療復(fù)發(fā)和耐藥的Ph+ALL，能使其獲得血液學(xué)或骨髓反應(yīng)，但其持續(xù)時間較短，很快發(fā)生繼發(fā)耐藥，這反映了其單藥治療的局限性，必須與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用以克服耐藥。

對于難治復(fù)發(fā)的白血病患者,我們吸收、應(yīng)用國際上先進(jìn)方案FLAG、CAG、B-NHL86等治療方法，白細(xì)胞去除術(shù)搶救高白細(xì)胞性急性白血病,也取得一些療效。

4.慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）

慢性粒細(xì)胞白血病自從被描述至今已有一個半世紀(jì)之久，但治療進(jìn)展十分緩慢，中位存活期3-4年。上世紀(jì)七十年代開創(chuàng)的異基因骨髓移植使CML患者有了治愈的可能。上世紀(jì)八十年代干擾素的應(yīng)用是第一個可使少數(shù)CML慢性期患者獲得遺傳學(xué)緩解的藥物，但該藥對CML進(jìn)展期無效，亦不能 防止急變且患者須長期接受注射，易受多種副作用困擾，耐受性差。直至上世紀(jì)末特異性、靶向性治療藥物-甲磺酸伊馬替尼的問世，才為CML的治療開創(chuàng)了新紀(jì)元[5]，超過三分之二的慢性期患者和少數(shù)加速期患者有獲得完全遺傳學(xué)緩解甚或主要分子生物學(xué)緩解的可能，提高患者的生存質(zhì)量。特別是使急變期患者轉(zhuǎn)變?yōu)槁云?，獲得機(jī)會去做異基因干細(xì)胞移植而長期生存?，F(xiàn)在伊馬替尼已在我省廣泛應(yīng)用于慢粒治療,取得明顯效果。也有相當(dāng)一部分病人接受異基因造血干細(xì)胞移植而治愈。

5.慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）

慢性淋巴細(xì)胞白血病是一種B淋巴細(xì)胞腫瘤。根據(jù)WHO的定義，CLL與小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（SLL）同屬一種疾病，是SLL的白血病表現(xiàn)形式。過去所謂的T-CLL現(xiàn)歸屬于T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病。在我國，CLL僅占白血病的4.6%。

CLL的分期對判斷患者的預(yù)后和決定何時開始治療有重大意義。Rai分期法和Binet分期法根據(jù)淋巴結(jié)、肝脾腫大情況和紅細(xì)胞、血小板的減少程度將CLL作了分析，指導(dǎo)臨床治療，沿用多年。但是，僅依靠臨床表現(xiàn)的分期，不能準(zhǔn)確預(yù)測哪些低?；颊叩募膊M(jìn)展。據(jù)文獻(xiàn)報告，ZAP-70（Zeta鏈相關(guān)蛋白-70）和CD38等檢查結(jié)果有助于預(yù)測疾病活動程度。從今年開始,我省對慢淋病人進(jìn)行ZAP-70和CD38檢測,以指導(dǎo)治療。

治療方案的選擇：首選治療方案以嘌呤類似物為主，如氟達(dá)拉濱、氟達(dá)拉濱+美羅華等；也可選用經(jīng)典的瘤可寧+強(qiáng)的松或COP及干擾素治療。

6.惡性淋巴瘤

我國報告的惡性淋巴瘤絕大多數(shù)為非霍奇金淋巴瘤(NHL),HL不足10%。在NHL中,中高度惡性淋巴瘤所占比例又高達(dá)80%以上。由于淋巴瘤中存在TCR和IgH基因重排,PCR可以區(qū)別反應(yīng)性增生淋巴結(jié)病還是惡性淋巴瘤。淋巴瘤分型也因此由病理、免疫發(fā)展到核型和分子病理學(xué)分型的階段。治療上除應(yīng)用傳統(tǒng)的化、放療外,還采用氟達(dá)拉濱、針對CD20靶向免疫治療藥物-美羅華等新療法[6]，提高療效。自體骨髓移植和異體造血干細(xì)胞移植治療惡性淋巴瘤,不僅使許多病例延長了生存期,而且使其中部分病例獲得治愈。對于療效的監(jiān)測，我們也應(yīng)用最先進(jìn)的PET-CT影像學(xué)技術(shù)定期隨訪病變情況。

7.多發(fā)性骨髓瘤（MM）

多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞的惡性腫瘤。如不進(jìn)行治療，進(jìn)展期MM患者的中位生存期僅為6個月。常規(guī)化療的治療有效率為40%~60%，完全緩解率低于5%，中位生存期不超過3年。約25%的患者能存活5年以上，存活10年的MM不到5%。對于新診斷的多發(fā)性骨髓瘤患者,我們采取MP,VAD加沙利度胺等方案治療,相當(dāng)部分的病人病情控制穩(wěn)定。近幾年來隨著對MM生物學(xué)特性的深入研究，形成了新的治療思路，著眼于MM細(xì)胞內(nèi)信號通路，骨髓微環(huán)境及二者的相互作用，涌現(xiàn)出一批新的靶向藥物如蛋白酶抑制劑萬珂，與傳統(tǒng)化療以及造血干細(xì)胞移植等治療手段的聯(lián)合極大地提高了MM治療的有效率，特別是CR率，但在我省只有個別病例使用，尚待更多的臨床療效觀察。

8.骨髓增生異常綜合征（MDS）

骨髓增生異常綜合征是一組起源于造血干細(xì)胞的獲得性克隆性疾患，其特征性病理改變是克隆性造血干/祖細(xì)胞發(fā)育異常和無效造血，其基本臨床特征是骨髓中造血細(xì)胞有發(fā)育異常的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和外周血中血細(xì)胞減少，轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙运栊园籽〉奈ｋU性很高。2001年，WHO頒布造血組織和淋巴組織腫瘤新的分類方案中將MDS的診斷分型與1982年FAB標(biāo)準(zhǔn)相比做了一些修訂,特別是將MDS和AML骨髓原始細(xì)胞的分界降低為0.20，取消了RAEB-t亞型。MDS的治療對于大多數(shù)病程平穩(wěn)，主要表現(xiàn)頑固性血細(xì)胞減少，而基本上沒有惡性表征的患者，治療目標(biāo)應(yīng)是提高血細(xì)胞數(shù)量和保持較好的生活質(zhì)量。我們在臨床上主要采用小劑量阿糖胞苷等的誘導(dǎo)分化治療和支持治療。

9.特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）

特發(fā)性血小板減少性紫癜是一種免疫介導(dǎo)的血小板減少綜合征，是臨床最常見的出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30%。ITP為自身免疫性疾病，目前尚無根治的方法，治療上主要采用免疫療法。治療的目的是使患者的血小板計(jì)數(shù)提高到安全水平，防止嚴(yán)重出血，降低病死率；而不是使患者的血小板計(jì)數(shù)達(dá)到正常。潑尼松仍是ITP一線治療藥物，大劑量地塞米松也在臨床取得滿意的效果。應(yīng)用大劑量地塞米松時，應(yīng)注意檢測血壓、血糖的變化，并注意預(yù)防感染，保護(hù)胃粘膜。大劑量靜脈用丙種球蛋白也在臨床上用于搶救重型ITP患者。

10.造血干細(xì)胞移植的進(jìn)展

自上世紀(jì)60年代造血干細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床開始，移植技術(shù)不斷進(jìn)步，日趨成熟，亦更為安全有效，已經(jīng)成為治愈各型白血病、淋巴瘤等惡性血液病及再障、某些實(shí)體瘤、自身免疫性疾病及部分遺傳性疾病的有效方法。

異基因造血干細(xì)胞移植中有近85%是同胞全相合異基因造血干細(xì)胞移植（Allo-HSCT），是目前應(yīng)用最多也是最為成熟的異基因移植方式。單倍型HSCT和非清髓HSCT在臨床上也有開展。

我省首例造血干細(xì)胞移植于1990年由福建醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院開展，當(dāng)時對一名急性淋巴細(xì)胞白血病青年行自體骨髓移植成功，之后福州總醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省腫瘤醫(yī)院，泉州市第一醫(yī)院，三明市第一醫(yī)院，龍巖市第一醫(yī)院，廈門市第一醫(yī)院相繼開展自體造血干細(xì)胞移植。異基因造血干細(xì)胞移植在此基礎(chǔ)上也迅速開展。1996年，福建省腫瘤醫(yī)院首先開展外周血干細(xì)胞采集，并開展自體外周血干細(xì)胞治療實(shí)體瘤。2000年，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院與福建省腫瘤醫(yī)院合作，開展異基因外周血干細(xì)胞移植治療慢性粒細(xì)胞白血病，此例移植后至今仍然在工作崗位上。此后在福州總醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、泉州市第一醫(yī)院、廈門市中山醫(yī)院、漳州市醫(yī)院均相繼開展異基因外周血干細(xì)胞移植，病種覆蓋急慢性白血病、惡性淋巴瘤、急性再生障礙性貧血和陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿等。2002年，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院開展我省首例非親緣造血干細(xì)胞移植治療慢性粒細(xì)胞白血病，之后非親緣造血干細(xì)胞移植治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤相繼在廈門市中山醫(yī)院和泉州市第一醫(yī)院開展。2004年起，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院開展供者淋巴細(xì)胞輸注治療骨髓移植后復(fù)發(fā)的白血病的研究。

我省自體造血干細(xì)胞移植例數(shù)超過150例，除應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤外，還包括風(fēng)濕病等自身免疫性疾病。異基因外周血造血干細(xì)胞移植例數(shù)超過120例,非親緣造血干細(xì)胞移植18例。我省也積極參與中華骨髓庫的資料登記,已外送非親緣造血干細(xì)胞21例。龍巖市第一醫(yī)院開展造血干細(xì)胞移植治療血栓閉塞性脈管炎取得良好療效。

(二)基礎(chǔ)研究

1.基因治療研究:主要開2個主要方面的研究,即核酸藥物及免疫基因治療。重點(diǎn)開展抗癌基因新藥反義核酸的研究，設(shè)計(jì)和研制成功抗癌基因新藥Bcl-2反義核酸，藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)它對白血病和惡性淋巴瘤裸鼠移植瘤有良好的療效，單獨(dú)應(yīng)用時能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時，能逆轉(zhuǎn)腫瘤對化療藥物的耐藥性，提高治療效果。并進(jìn)行ASODN臨床前的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)及毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，是國內(nèi)最早開展抗癌基因藥物反義核酸的研究單位之一，"Bcl-2反義硫代磷酸寡脫氧核苷酸對白血病細(xì)胞系基因治療的系列研究"獲2000年省科技進(jìn)步三等獎。RNA干擾（RNAi）是1998年以來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的一門新興的基因阻斷高新技術(shù)，小干擾RNA（siRNA）代替反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已經(jīng)應(yīng)用到基因功能和基因治療研究中。我科在開展反義核酸研究的基礎(chǔ)上，正在開展siRNA的設(shè)計(jì)、研制和抗腫瘤效應(yīng)研究。同時開展抗bcr/abl融合基因核酶對慢性粒細(xì)胞白血病基因治療及自體骨髓凈化研究，有望用于CML自體骨髓移植的體外凈化，并對野生型p53基因誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究。

基因免疫治療方面的研究有基因瘤苗治療淋巴瘤和白喉毒素真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對B細(xì)胞惡性腫瘤的選擇性殺傷作用的研究，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，成功地構(gòu)建了含Igκ輕鏈基因啟動子/增強(qiáng)子抗百咳毒素A鏈基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)Igκ輕鏈腫瘤細(xì)胞（CA46細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)其能特異性抑制CA46細(xì)胞增殖。還應(yīng)用基因工程技術(shù)，制備GM-CSF和B7.1基因修飾的淋巴瘤細(xì)胞瘤苗，它能有效地激發(fā)親本小鼠抗淋巴瘤免疫反應(yīng)，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，有望用于清除淋巴瘤微小殘留病。以上這些研究總體居國內(nèi)先進(jìn)水平，有些為國內(nèi)率先開展、報告。

2.開展細(xì)胞因子與造血調(diào)控的研究:主要涉及以下幾方面：①血小板反應(yīng)蛋白（TSP）以及類肝素物質(zhì)對巨核細(xì)胞生長的作用及其機(jī)制；②正常血細(xì)胞分化各階段及各個類型白血病細(xì)胞的細(xì)胞因子及其受體表達(dá)的研究；③急性白血病TGFβ1水平的變化及意義；④外源性TGFβ1、wt-p53、全反式維甲酸、三氧化二砷調(diào)控白血病細(xì)胞因子和受體以及bcl-2、c-myc、端粒酶活性表達(dá)及其與白血病細(xì)胞分化、凋亡的關(guān)系；⑤TGFβ1、TNFα、反義寡脫氧核苷酸對白血病細(xì)胞凋亡和造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響。取得如下結(jié)果：①在國際上首次發(fā)現(xiàn)TSP是巨核細(xì)胞生成的負(fù)調(diào)控因子并發(fā)現(xiàn)其功能基團(tuán)，類肝素物質(zhì)-藻酸雙酯鈉對CFU-MK的形成具有刺激作用；②CD34+造血干細(xì)胞表達(dá)多種正性細(xì)胞因子及受體，隨著細(xì)胞分化成熟，正性細(xì)胞因子表達(dá)逐漸減少，而負(fù)性細(xì)胞因子TGFβ1、TNFα則持續(xù)存在；③白血病細(xì)胞亦可同時表達(dá)多種正性細(xì)胞因子，但作為最強(qiáng)的負(fù)性細(xì)胞因子TGFβ1在急性白血病的表達(dá)水平低于正常人，急性白血病緩解后，TGFβ1水平恢復(fù)正常，復(fù)發(fā)患者其TGFβ1水平又趨降低，并發(fā)現(xiàn)原代急性白血病細(xì)胞存在TGFβ1Ⅱ型受體異構(gòu)體。說明白血病細(xì)胞存在正、負(fù)細(xì)胞因子失衡；④全反式維甲酸、wt-p53、三氧化二砷誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化凋亡過程中，伴有內(nèi)源性TGFβ1、TNFα表達(dá)上調(diào)，bcl-2、c-myc表達(dá)下調(diào)，端粒酶活性下降，而反義TGFβ1、TNFα寡脫氧核苷酸能夠阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并使bcl-2表達(dá)水平恢復(fù)，提示內(nèi)源性TGFβ1、TNFα是促進(jìn)白細(xì)胞分化的內(nèi)在動力。⑤TGFβ1、TNFα反義寡脫氧核苷酸可提高CD34+造血干細(xì)胞數(shù)量和CFU-GEMM集落數(shù)，提示阻斷內(nèi)源性TGFβ1、TNFα可能是造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的有效途徑之一。

上述研究成果多為國際上首先報道，豐富了造血及白血病的基礎(chǔ)理論知識，系列研究在《Br. J. Hematol》[7]、《J Lab Clin Med》等刊物上，并在國際學(xué)術(shù)會議上做報告。

3.開展植物有效成分治療白血病的研究:這方面有較好基礎(chǔ)，是國內(nèi)最早開展三尖杉酯堿治療白血病研究的單位之一，獲得全國科學(xué)大會獎；并設(shè)計(jì)以三尖杉酯堿為主的HOAP方案治療急性白血病，還在國際上首創(chuàng)三尖杉酯堿治療真性紅細(xì)胞增多癥新療法，獲國家科技進(jìn)步三等獎。我們在國際上率先開展了雷公藤內(nèi)酯醇治療白血病的實(shí)驗(yàn)、臨床研究以及姜黃素治療白血病及淋巴瘤的實(shí)驗(yàn)研究，取得了一系列創(chuàng)新性成果。雷公藤內(nèi)脂醇與多種抗癌藥物具有協(xié)同作用，能逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥性，其抗癌機(jī)制可能是通過抑制白血病細(xì)胞bcl-2的表達(dá)并激活Caspase-3而發(fā)揮作用。它還可通過下調(diào)Ras/Raf/MEK/Erk途徑的信號傳導(dǎo)，最終減少轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的含量而抑制細(xì)胞的增殖。在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，首次進(jìn)行雷公藤內(nèi)酯醇（國產(chǎn)抗腫瘤一類新藥）Ⅰ~Ⅱ期臨床研究，發(fā)現(xiàn)該藥具有良好的抗白血病作用，有望成為一種抗白血病的新藥。本學(xué)科還通過從天然植物姜黃中提取姜黃素，研究姜黃素對慢粒細(xì)胞系K562細(xì)胞的抗癌活性及其對酪氨酸激酶的影響，結(jié)果表明姜黃素可特異性下降P210蛋白的表達(dá)，抑制其激活的Ras信號途徑，從而抑制細(xì)胞增殖；引起國內(nèi)外的關(guān)注，其中"姜黃素的抗癌活性及其對癌細(xì)胞周期與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響"獲得由歐洲腫瘤學(xué)會、中國癌癥研究基金會聯(lián)合頒發(fā)的2001'DEBIO-CCRF中國獎，相關(guān)研究還獲省科技進(jìn)步二等獎，并獲中國專利1項(xiàng)。此外，進(jìn)行姜黃素對HL60細(xì)胞及CA46細(xì)胞的抗癌活性研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過下調(diào)c-myc、bcl-2、突變型P53及上調(diào)Fas的表達(dá)而抑制HL60細(xì)胞和CA46細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前正在擴(kuò)大姜黃素對惡性血液病治療的實(shí)驗(yàn)研究，如對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266的作用，初步研究結(jié)果顯示其對骨髓瘤細(xì)胞有增殖抑制作用并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制目前正在研究中。由于姜黃素對正常細(xì)胞毒性低，因而是一種很有開發(fā)前景的抗白血病新藥，該研究課題獲國家教育部資助，并是福建省自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目課題，目前我們還研究該藥抗白血病的分子機(jī)制，上述研究已產(chǎn)生或?qū)a(chǎn)生明顯經(jīng)濟(jì)及社會效益。

其他正在研究的植物單體成份還有大黃素等，同樣也有類似的抗白血病效應(yīng)。

4.開展骨髓凈化的實(shí)驗(yàn)研究:系統(tǒng)研究了烷化溶血磷脂（ALP）對急慢性白血病骨髓的凈化作用，采用ALP和Bcl-2反義核苷酸提高凈化療效。針對慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）自體骨髓移植效果差的問題，研究了CML自體樹突狀細(xì)胞活化的骨髓細(xì)胞凈化CML骨髓，結(jié)果表明對Ph陽性CML有肯定的凈化效果。還在國際上首先研究光敏劑ZnPc-PDT對正常造血細(xì)胞的影響及對白血病細(xì)胞的殺傷作用，同時對模擬緩解骨髓中K562細(xì)胞的凈化作用也作了研究，并在體外研究其凈化效果及對HL60細(xì)胞的體內(nèi)殺傷作用，進(jìn)而聯(lián)合ZnPc-PDT與免疫瘤苗治療小鼠淋巴瘤。研究表明ZnPc-PDT具有體內(nèi)外抗血液腫瘤細(xì)胞的作用，對體外實(shí)驗(yàn)時正常MNC中摻入的K562細(xì)胞及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時骨髓移植物中摻入的EL9611細(xì)胞有較好的凈化作用，與免疫瘤苗聯(lián)合發(fā)揮顯著的抗淋巴瘤效應(yīng)，為ZnPc-PDT應(yīng)用于治療血液腫瘤臨床提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在惡性血液病的免疫治療方面，采用供者淋巴細(xì)胞輸注聯(lián)合小劑量化療治療骨髓移植后復(fù)發(fā)的白血病，觀察到一定的治療效果，為進(jìn)一步深入開展白血病的過繼免疫治療打下基礎(chǔ)。應(yīng)用烷化溶血磷酯反義技術(shù)、樹突狀細(xì)胞及信號傳導(dǎo)阻滯劑用于白血病骨髓凈化的研究已經(jīng)得取了階段性成果，并繼續(xù)深入研究中。

三、教學(xué)及學(xué)術(shù)交流

分會積極培養(yǎng)高層次人才，掛靠單位福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院、福建省血液病研究所創(chuàng)建基因工程實(shí)驗(yàn)室，引進(jìn)先進(jìn)的分子生物學(xué)儀器設(shè)備，開展高水平的科研工作，使學(xué)科具備較強(qiáng)的科研實(shí)力和較高的學(xué)術(shù)水平，部分研究成果具有國內(nèi)領(lǐng)先和國際水平，1982年成為福建醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)碩士點(diǎn)，1990年成為福建醫(yī)科大學(xué)第一個臨床醫(yī)學(xué)博士點(diǎn)，2001年經(jīng)國家批準(zhǔn)為福建醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)博士后科研流動站，已培養(yǎng)博士生40名，碩士生77名。

分會在積極培養(yǎng)高層次人才同時，不忘為我省培養(yǎng)年輕醫(yī)師，組織培養(yǎng)全省各級進(jìn)修、輪轉(zhuǎn)及通科培訓(xùn)人員。承擔(dān)福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療系、口腔系、檢驗(yàn)系、預(yù)防醫(yī)學(xué)系、高護(hù)系、麻醉系、影像學(xué)系、美容、衛(wèi)管、全科等各專業(yè)本科、醫(yī)專班以及成人教育班的診斷學(xué)、內(nèi)科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)概論、臨床血液學(xué)及實(shí)驗(yàn)血液學(xué)的教學(xué)工作，包括上大課、實(shí)驗(yàn)課，同時還承擔(dān)醫(yī)學(xué)系、檢驗(yàn)系的臨床見習(xí)教學(xué)及實(shí)習(xí)指導(dǎo)任務(wù)。認(rèn)真抓好教學(xué)工作，經(jīng)常進(jìn)行教學(xué)查房、?？浦v座、技能操作培訓(xùn)，為實(shí)習(xí)及見習(xí)同學(xué)創(chuàng)造良好環(huán)境。

分會積極組織開展省內(nèi)、國內(nèi)及國際學(xué)術(shù)交流活動，邀請國外專家舉行專題講座，分會委員參加國際血液病學(xué)術(shù)會議，赴國外學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)進(jìn)修學(xué)習(xí)。為提高學(xué)科專業(yè)技術(shù)水平與促進(jìn)學(xué)科發(fā)展，定期開展全省血液病學(xué)術(shù)交流活動，疑難病例討論會，至今共召開了十一次全省血液病學(xué)學(xué)術(shù)會議，承辦了3次全國性血液病學(xué)學(xué)術(shù)研討會。

雖然分會近年來取得了一些成績和進(jìn)展,但與國內(nèi)外先進(jìn)機(jī)構(gòu)相比還有相當(dāng)差距,今后更要努力加快工作,發(fā)揮優(yōu)勢,爭取趕上國內(nèi)外先進(jìn)水平。

參考文獻(xiàn):

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課題組成員：

1.胡建達(dá): 教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師,福建省血液病研究所副所長

2.楊鳳娥:福建省血液病研究所主任醫(yī)師