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摘要：以釀酒酵母中已經(jīng)報道的5個典型PITP序列為基礎，對炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行Blastp比對以及
關(guān)鍵詞 搜索，并通過SMART保守結(jié)構(gòu)域分析，明確該菌含有4個典型的PITP；同時，通過對上述氨基酸序列進行疏水性、細胞信號肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位以及二級結(jié)構(gòu)等生物信息學分析，并與其他物種中15個同源序列進行遺傳關(guān)系比較分析，以期為深入開展希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc．）PITP的功能研究打下理論基礎，同時，也為進一步開展其他炭疽菌的研究提供重要的理論指導。
關(guān)鍵詞 ：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc．）；磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)；生物信息學分析；遺傳關(guān)系；炭疽菌屬
中圖分類號：Q81文獻標識碼：A文章編號：0439－8114（2015）03－0713-04
希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc．）屬于炭疽菌屬真菌，其可以侵染如菜心、小油菜、結(jié)球甘藍、羽衣甘藍、大白菜、蘿卜等多種十字花科蔬菜作物而引起炭疽病，是一類重要的世界性植物真菌病害，現(xiàn)主要分布于美國、中國、日本以及印度等國［1－3］。在我國，由該病菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常見和發(fā)生最嚴重的病害之一［4］。該病害對廣東省菜心種植地區(qū)具有重要的影響，不僅降低了菜心的產(chǎn)量，對菜心的品質(zhì)也產(chǎn)生了較大影響［5，6］。國內(nèi)外對該病菌的研究主要集中在生物學特性、生防菌篩選以及遺傳轉(zhuǎn)化等方面［7，8］，同時，隨著該病菌基因組序列的釋放［9］，林春花等［10］對其開展了MAPK途徑相關(guān)基因的找尋及信號通路簡圖的繪制工作。
磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)（Phosphatidylinositol transfer protein，PITP）是一類廣泛存在于真核生物細胞中具有一個疏水性強的水溶性蛋白質(zhì)載體，其功能在于把一分子的脂類物質(zhì)包裹在疏水腔內(nèi)，使包裹的脂類物質(zhì)遠離細胞質(zhì)內(nèi)水溶性的環(huán)境，從而實現(xiàn)脂類物質(zhì)在不同膜間定向轉(zhuǎn)運［11］。該蛋白質(zhì)通過參與調(diào)節(jié)脂類代謝途徑和胞內(nèi)進程，從而在多個復雜的生理發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［12］。目前，認為在肌醇磷脂代謝途徑中發(fā)揮重要作用的有PITP－PLC（磷脂酶C）途徑、CDP（胞嘧啶核苷二磷酸）－膽堿生物合成途徑［13，14］。學術(shù)界對于植物中所含有的PITP有較多報道，如大豆、日本百脈根、擬南芥以及棉花等，而對于真菌PITP的研究報道較為少見。
本研究以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288c）中已經(jīng)報道的5個典型PITP氨基酸序列為基礎，通過在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行Blastp比對分析以及
關(guān)鍵詞 搜索，獲得與釀酒酵母PITP同源的C． higginsanum序列，并通過保守結(jié)構(gòu)域分析、疏水性分析、二級結(jié)構(gòu)預測等生物信息學分析，以期明確該菌中所存在的PITP數(shù)量、疏水性特點、結(jié)構(gòu)特征以及細胞定位情況，同時，基于上述PITP氨基酸序列，在美國國家生物信息中心（NCBI）在線進行同源序列搜索，通過遺傳關(guān)系分析，以期為進一步開展其他炭疽菌中PITP的研究提供理論指導。
1材料與方法
1．1材料
根據(jù)釀酒酵母中含有的5個PITP（Sec14、Pdr16、Pdr17、Sfh5和CSR1）氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫在線進行Blastp比對［15］，所有參數(shù)均選擇默認值，獲得C． higginsianum中所含有的典型PITP，同時，通過輸入“Phosphatidylinositol－transfer－protein”、“PITP”
關(guān)鍵詞 ，在上述數(shù)據(jù)庫中進行PITP檢索；另外，利用NCBI明確該菌中PITP蛋白質(zhì)登錄號信息（表1）。
1．2方法
1．2．1 保守結(jié)構(gòu)域預測利用SMART網(wǎng)站在線分析PITP所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征。
1．2．2蛋白質(zhì)疏水性預測利用Protscale程序［16］對PITP進行疏水性測定。
1．2．3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運肽及信號肽預測轉(zhuǎn)運肽的預測利用TargetP 1．1 Server進行在線分析［17］，信號肽預測則是利用SignalP 3．0 Server［18］進行在線分析。
1．2．4蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預測對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測采用PHD［19］進行在線分析。同時，對其PITP的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進行預測，利用TMHMM Server v． 2．0進行在線分析［18］。
1．2．5亞細胞定位分析對C． higginsianum中PITP進行亞細胞定位分析，利用ProtComp v.9．0進行在線分析［20］。
1．2．6系統(tǒng)進化樹構(gòu)建在NCBI中，以C． higginsianum中所含PITP氨基酸序列為基礎，在線進行Blastp同源搜索，獲得來自不同物種的同源蛋白質(zhì)序列。對所獲得的同源序列，利用Clustal X軟件［21］進行多重比對分析，隨后利用MEGA 5．2．2軟件［22］構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支之間的距離計算采用p－distance模型，系統(tǒng)可信度檢測采用自舉法重復1 000次進行。
2結(jié)果與分析
2．1希金斯炭疽菌含有4個典型的PITP
對釀酒酵母中典型的5個PITP進行SMART分析，明確上述PITP均具有SEC14保守域結(jié)構(gòu)，除Sfh5外，其他4個還具有一個存在于氨基酸序列N端，且尚未知功能的CRAL＿TRIO＿N保守域結(jié)構(gòu)，同時，上述典型PITP所含氨基酸的大小范圍為343～469 aa。
對炭疽菌屬進行Blastp比對分析，除Sec14、CSR1具有同源的序列外，其他3個（Pdr16、Pdr17、Sfh5）在希金斯炭疽菌中均沒有發(fā)現(xiàn)其同源序列。同時，結(jié)合
關(guān)鍵詞 搜索，結(jié)果表明，C． higginsianum中存在4個與酵母中PITP同源性較高序列，其ID分別為CH063＿00815．1、CH063＿06673．1、CH063＿01014．1、CH063＿10638．1。根據(jù)SMART保守域分析，結(jié)果顯示，上述4個蛋白質(zhì)序列均含有典型PITP所具有的SEC14保守域（圖1），按照氨基酸長度，重新對上述希金斯炭疽菌中的典型PITP進行命名，分別為ChPITP1、ChPITP2以及ChPITP3、ChPITP4（表1）。
2．2蛋白質(zhì)疏水性預測
疏水性分析結(jié)果顯示，ChPITP1中位于291位的E，親水性最強，數(shù)值達到－1．995，而位于179位的D，親水性最弱，為0．921；ChPITP2中位于314、317位的Q、W，親水性最強，而位于248位的T，親水性最弱；ChPITP3中位于62位的T，親水性最強，而位于294位的W，親水性最弱；ChPITP4中位于66位的V，親水性最強，而位于255位A，其親水性最弱（表2，圖2）。同時，發(fā)現(xiàn)ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4這4個典型PITP盡管在親水性最強氨基酸殘基位置和數(shù)值、疏水性最強氨基酸殘基位置和數(shù)值、疏水性氨基酸殘基數(shù)值總和以及親水性氨基酸殘基數(shù)值總和等方面的結(jié)果不盡相同，但均屬于親水性蛋白質(zhì)，這與通過理化性質(zhì)分析中的GRAVY計算所得結(jié)果一致。
2．3轉(zhuǎn)運肽及信號肽特征
通過分析，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4具有分泌途徑信號肽的可能性最大，其預測值分別為0．948、0．961、0．854、0．924（表3）。經(jīng)過SingnalP 3．0 Server在線分析，上述4個PITP均不含有明顯的信號肽序列。
2．4二級結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)域預測
二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，4個PITP均含有α螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)，其中，ChPITP1、ChPITP3、ChPITP4所含α螺旋比例較高，分別為49％、51％、46％，而在ChPITP2中，其所含無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)所占比例較高，為44％；對于β折疊結(jié)構(gòu)，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4所含比例均較低（圖3）。
通過TMHMM Server v． 2．0在線分析，上述4個PITP均不含有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，然而，通過二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)ChPITP4在281到311位氨基酸之間存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域，兩者預測不同，有待于今后通過試驗進一步驗證。
2．5亞細胞定位分析
通過ProtComp v. 9.0在線分析，結(jié)果表明，4個典型的PITP亞細胞定位情況不盡相同，其中，ChPITP1、ChPITP2定位于高爾基體中，而ChPITP3定位于線粒體上，ChPITP4定位于細胞質(zhì)中（表4）。
2．6遺傳關(guān)系
在NCBI中，通過對C． higginsianum 4個典型PITP序列進行Blastp搜索，分別獲得ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4的同源序列，選擇同源性較高的15條序列進行聚類分析，結(jié)果顯示，上述4個PITP與其各自同源序列分別聚在一起，而彼此之間并未聚在一起；就C． higginsianum中每一個PITP與其他物種同源序列之間的親緣關(guān)系而言，ChPITP1與禾谷炭疽菌中的EFQ27511．1、西瓜炭疽病菌中的ENH76666．1之間親緣關(guān)系較近；ChPITP2與大麗輪枝菌中的EGY17177．1、黑白輪枝菌中的XP003005673．1親緣關(guān)系較近；ChPITP3與C． graminicola中的EFQ29482．1之間的親緣關(guān)系較近；ChPITP4與C． graminicola中的EFQ30498．1之間的親緣關(guān)系較近（圖4），這與前期關(guān)于禾谷炭疽菌PITP的親緣關(guān)系研究所得結(jié)果一致［23］。
3小結(jié)與討論
C． higginsanum可侵染菜心、白菜等眾多十字花科蔬菜引起炭疽病，不僅影響蔬菜的產(chǎn)量，也對其品質(zhì)造成重要影響。深入開展該病菌的致病因子研究，有助于進一步開發(fā)以致病因子為作用靶標的防治藥劑。2012年，隨著該菌全基因組序列的釋放［9］，為學術(shù)界對其開展致病因子研究提供了便利條件。
目前，已經(jīng)明確PITP參與真核生物體內(nèi)眾多生理功能以及信號轉(zhuǎn)導過程，然而，對于真菌中PITP的報道尚不多見。本研究基于釀酒酵母中已經(jīng)報道的5個典型PITP序列，在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，利用Blastp比對以及
關(guān)鍵詞 搜索，同時，基于SMART保守域分析，共獲得C． higginsanum 4個典型的PITP。利用生物信息學分析，初步明確了上述4個典型PITP在細胞信號肽、疏水性、亞細胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域以及二級結(jié)構(gòu)等方面具有的特征，為深入解析C． higginsanum PITP的功能研究打下堅實基礎。與此相似，通過上述方法，也獲得了C． graminicola中含有3個PITP，并明確上述PITP具有的相關(guān)特征。在炭疽菌屬病菌中上述2種全基因組測序已經(jīng)完成，而大多數(shù)危害農(nóng)、林業(yè)生產(chǎn)的炭疽菌的全基因組測序尚未完成，因此，本研究基于C． higginsanum中典型PITP，通過遺傳關(guān)系比較分析，可為進一步開展其他炭疽菌屬真菌中PITP研究提供重要的理論指導。
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2 結(jié)果與分析
2.1 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析
對不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，該酶含有328個氨基酸，總相對分子量為35 161.2，理論等電點pI值為9.03，負電荷氨基酸（Asp+Glu） 37個，正電荷氨基酸（Arg+Lys）36個，分子式C1558H2507N433O473S9，原子總數(shù)
4 980，摩爾消光系數(shù)1.043（胱氨酸全按半胱氨酸計），該酶蛋白不穩(wěn)定性參數(shù)為20.46，屬于穩(wěn)定蛋白，其脂肪系數(shù)為99.54，平均親水性（GRAVY）為0.006，預測該蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)。
2.2 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域及疏水性的預測和分析
用TMpred在線軟件對不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果（圖1）表明，不結(jié)球白菜BcGAPDH整條肽鏈都位于細胞膜外，說明其不存在跨膜區(qū)。此外，利用在線軟件PHDhtm和ANTHEPROT對該酶跨膜螺旋進行預測，結(jié)果與TMpred所預測的結(jié)果一致，即均沒有跨膜螺旋。因此，此被預測的跨膜螺旋區(qū)可信度較高。
蛋白質(zhì)的疏水性分析是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)預測中一個必要過程，通過分析可以得到蛋白質(zhì)的親疏水區(qū)域，一方面為二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果提供參考，另一方面為結(jié)構(gòu)域以及功能域的劃分提供依據(jù)。因此，對不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列進行疏水性分析，結(jié)果（圖2）表明，多肽鏈第304位的氨基酸具有最低分值-4.500，親水性最強；第212位的氨基酸具有最高分值4.200，疏水性最強。整體來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸。因此，整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，沒有明顯的疏水區(qū)域，可認為不結(jié)球白菜BcGAPDH是親水性蛋白質(zhì)。結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)域的預測結(jié)果，可以推斷不結(jié)球白菜BcGAPDH不存在明顯的疏水區(qū)域，與其不存在跨膜結(jié)構(gòu)域的特征相吻合。
2.3 不結(jié)球白菜BcGAPDH信號肽及亞細胞定位的預測和分析
信號肽分析有助于蛋白質(zhì)功能域的區(qū)分及蛋白質(zhì)細胞定位。SignalP v3.0軟件是神經(jīng)網(wǎng)絡、隱馬爾科夫模式工具[12]，將不結(jié)球白菜BcGAPDH的ORF通過該軟件分析（圖3），獲得ORF的Cmax值為0.083、Ymax值為0.083、Smean值為0.561、Smean值為0.182，前3個值的位點分別在第25、25、1位。根據(jù)軟件的默認選擇，將Cmax值>0.5和Smean值>0.5的ORF確定為具有信號肽。根據(jù)分析結(jié)果，此信號肽計算結(jié)論為NO，表示沒有信號肽存在。
對基因產(chǎn)物在亞細胞位置的了解對判定這些基因產(chǎn)物的功能起著重要作用。用Target P server程序進行不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的亞細胞定位，結(jié)果表明，基本確認BcGAPDH蛋白質(zhì)在線粒體中發(fā)揮生物學作用，氨基酸序列長度為328個，定位于葉綠體、線粒體和其他細胞部分的得分分別為0.031、0.745、0.572，作為信號肽的可能性為0.018，軟件的最終定位預測在線粒體，可信度為5。用 Subloc V server和WOLFPSORT server程序進行驗證分析，結(jié)果一致。
2.4 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的模體分析
將不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的氨基酸序列利用在線軟件ScanProsite進行分析，發(fā)現(xiàn)其含有多種模點（圖4），其中包括1個氨基化合物位點（M1），1個依賴于cAMP或cGMP的蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點（M2），6個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（M3），3個N-糖基化位點（M4），6個N-肉豆蔻?；稽c（M5），4個蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點（M6）。
2.5 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測分析
利用SOPMA在線工具預測不結(jié)球白菜 BcGAPDH蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示，BcGAPDH含有比較豐富的二級結(jié)構(gòu)，由112個氨基酸殘基組成α螺旋結(jié)構(gòu)，占全部氨基酸殘基的34.15%；82個氨基酸殘基組成延伸鏈，占全部氨基酸殘基的25.00%；由21個氨基酸殘基組成β轉(zhuǎn)角，占全部氨基酸殘基的6.40%；由113個氨基酸殘基組成隨機卷曲，占全部氨基酸的34.45%。可以看出，隨機卷曲和α-螺旋是BcGAPDH多肽鏈中的主要結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈散布于整個蛋白質(zhì)中。
2.6 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預測
將不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列上傳到SWISS-MODEL的建模服務器中進行三維建模[13，14]，然后在ViewerLite 4.2軟件中進行序列編輯，獲得BcGAPDH的三級結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖6所示。
3 討論
GAPDH生物學的多功能性基于不同的研究結(jié)果，這些新的發(fā)現(xiàn)可以分為2組：第1組包括鑒定GAPDH新活性的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAPDH有別于傳統(tǒng)的脫氫酶活性的新功能；第2組包括鑒定GAPDH與細胞內(nèi)大分子的特異性結(jié)合，為GAPDH新功能提供了重要證據(jù)。
早期的研究證明GAPDH是一個膜結(jié)合蛋白[15]，發(fā)現(xiàn)細胞中60%～70%的GAPDH能與膜結(jié)合，但不結(jié)球白菜BcGAPDH不具有該活性，因為通過本試驗分析該酶無跨膜區(qū)，是親水性蛋白質(zhì)。另外，研究表明，GAPDH還具有磷酸轉(zhuǎn)移酶/激酶的活性，不僅能自身磷酸化，而且還能磷酸化其他蛋白質(zhì)。本試驗對不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的模體分析發(fā)現(xiàn)，該酶包括蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點，表明BcGAPDH在不結(jié)球白菜體內(nèi)具有磷酸化活性，BcGAPDH在其細胞病毒生理學上可能扮演著重要角色。
GAPDH廣泛存在于眾多生物體中，并且具有高度種屬保守序列，它作為一個多功能蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系仍有待研究。目前，GAPDH在機體的生理和病理狀態(tài)下的作用越來越引起有關(guān)學者的關(guān)注。但迄今為止，GAPDH在細胞中的功能還沒有完全搞清楚，因此，本試驗對不結(jié)球白菜BcGAPDH結(jié)構(gòu)和功能的分析將有助于研究者進一步了解GAPDH反應的機制及所需條件。
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作者簡介：李潔（1982—），女，河南商丘人，實驗師，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：lijie@gsau.edu.cn。
通信作者：王建福（1982—）男，河南商丘人，講師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：wangjf@gsau.edu.cn。
定西市安定區(qū)位于甘肅省中部，北緯35°17′54″至36°02′40″，東經(jīng)104°12′48″至105°01′06″，南北長82.9km，東西寬73.3km，海拔1700～2580m，屬典型的黃土高原干旱半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，抗旱生產(chǎn)是安定區(qū)農(nóng)業(yè)工作的重點。中晚熟玉米適宜海拔在2000m以下的區(qū)域種植[1]，而安定區(qū)大面積耕地海拔在2000m以上，中晚熟品種很難成熟，全膜雙壟溝播技術(shù)將玉米種植范圍擴大到海拔2100m區(qū)域[2-3]。為了考察早熟玉米新品種在安定區(qū)高海拔區(qū)的適應性、抗逆性、生產(chǎn)穩(wěn)定性，2017年安定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務中心引進了7個早熟玉米新品種進行比較試驗，以期篩選出適合當?shù)睾０?100m以上區(qū)域生產(chǎn)應用的玉米品種?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。
1材料與方法
1.1供試材料
參試玉米品種7個，其中武科早303、武科早304由武威市武科種業(yè)科技有限公司生產(chǎn)，甘玉804由甘肅種業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，興達1601、興達1602由甘肅興達種業(yè)有限公司生產(chǎn)，金穗606、金穗607及當?shù)爻Ｒ?guī)種植品種金穗3號（CK）由白銀金穗種業(yè)有限公司生產(chǎn)。
1.2試驗地概況
試驗設在定西市安定區(qū)團結(jié)鎮(zhèn)小山村，海拔2150m，年平均降水量430mm，年蒸發(fā)量1450mm，無霜期141d。前茬作物收獲后深耕曬垡，冬前淺耕耙耱。采用全膜雙壟溝播技術(shù)[4]，大壟寬70cm、高10cm，小壟寬40cm、高15cm。覆膜前結(jié)合整地一次性基施農(nóng)家肥45000kg/hm2、玉米專用肥（N-P2O5-K2O為20-15-15）1200kg/hm2。用50%辛硫磷乳油7.5kg/hm2加適量水噴拌細土450kg制成毒土，撒施地面后起壟覆膜以防治地下害蟲。用50%乙草胺乳油3750mL/hm2兌水600kg噴灑于壟溝表面芽前除草。
1.3試驗方法
試驗為隨機區(qū)組設計，每品種為1個處理，3次重復，小區(qū)面積39.6m2（11.0m×3.6m）。4月19日用玉米點播器播種，每穴2粒，播深4cm，行距55cm，株距30cm，密度為60000株/hm2。田間管理措施同當?shù)卮筇?。田間觀察記載物候期及主要農(nóng)藝性狀，成熟后按小區(qū)抽樣考種并單收計產(chǎn)。
2結(jié)果與分析
2.1生育期
從表1可以看出，各品種出苗期一致，均在5月2日。金穗607、武科早303、甘玉804、武科早304于6月中旬開始拔節(jié)，與金穗3號（CK）基本一致；興達1601、金穗606、興達1602拔節(jié)期較金穗3號（CK）遲13～16d。抽雄期武科早303、武科早304均為7月11日，較金穗3號（CK）早4d；興達1602與金穗3號（CK）一致；金穗606、興達1601、甘玉804較金穗3號（CK）晚2d。成熟期武科早303、武科早304、興達1602最早，8月下旬已經(jīng)成熟，較金穗3號（CK）早9d；金穗607、甘玉804、興達1601、金穗606均在9月上旬與金穗3號（CK）同期成熟。生育期武科早303、武科早304、興達1602均為117d，較金穗3號（CK）短9d；其他品種生育期為126d，與金穗3號（CK）相同。
2主要性狀
由表2可見，株高以金穗607、甘玉804、興達1601最高，均為2.5m，較金穗3號（CK）高出0.5m；武科早304、金穗606次之，均為2.4m，較金穗3號（CK）高出0.4m；武科早303、興達1602最低，為1.7m，較金穗3號（CK）低0.3cm。穗位以甘玉804、金穗606最高，為80.0cm，較金穗3號（CK）高12.5cm；金穗607次之，為73.0cm，較金穗3號（CK）高5.5cm；武科早303最低，為36.5cm，較金穗3號（CK）低31.0cm。穗長以興達1601最長，為23.0cm，較金穗3號（CK）長5.0cm；其次為甘玉804，為21.5cm，較金穗3號（CK）長3.5cm；武科早304最短，為17.5cm，較金穗3號（CK）短0.5cm；其他品種較金穗3號（CK）長0.5～2.0cm。穗粗以金穗606最粗，為15.6cm，較金穗3號（CK）粗0.1cm，其他品種較金穗3號（CK）細0.2～2.3cm。軸粗以武科早304最粗，為10.8cm，較金穗3號（CK）粗0.8cm；其次是金穗606，為10.3cm，較金穗3號（CK）粗0.3cm；其他品種較金穗3號（CK）細0.3～0.7cm。粒型武科早304、興達1602與金穗3號（CK）一致，均為半馬齒型，其余品種均為馬齒型。粒色除武科早303、武科早304為黃紅色外，其余品種均與金穗3號（CK）一致，為黃色。軸色金穗607、甘玉804、興達1602為淺粉色；武科早303、興達1601、金穗606和金穗3號（CK）均為棕紅色；武科早304為白色。
2.3產(chǎn)量及構(gòu)成因子
由表3可知，穗粒數(shù)金穗607最多，為630粒，較金穗3號（CK）多132粒；其次是甘玉804，為552粒，較金穗3號（CK）多54粒；其余品種均較金穗3號（CK）少。百粒重以金穗606最高，為31.6g，較金穗3號（CK）高8.2g；其次是武科早303，為28.4g，較金穗3號（CK）高5.0g；武科早304、興達1601分別為27.7、24.5g，較金穗3號（CK）分別高4.3、1.1g；其余品種均低于金穗3號（CK）。折合產(chǎn)量以武科早304最高，為8737.4kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)1186.9kg/hm2，增產(chǎn)率為15.7%；其次是武科早303，為8611.1kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)1060.6kg/hm2，增產(chǎn)率14.0%；金穗607居第3位，折合產(chǎn)量8585.9kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)13.7%；金穗606為8484.9kg/hm2，較金穗3號（CK）增產(chǎn)12.4%。對產(chǎn)量進行新復極差比較，各品種間產(chǎn)量差異均達到極顯著水平。
3小結(jié)
在安定區(qū)海拔2150m的旱區(qū)，對引進的7個玉米品種進行了引種試驗。結(jié)果表明，參試各玉米品種均可在9月中旬前成熟，武科早304、武科早303、金穗607、金穗606等4個品種綜合性狀優(yōu)良。其中武科早304折合產(chǎn)量最高，為8737.4kg/hm2，較對照品種金穗3號增產(chǎn)1186.9kg/hm2，增產(chǎn)率為15.7%；武科早303折合產(chǎn)量8611.1kg/hm2，較對照品種金穗3號增產(chǎn)1060.6kg/hm2，增產(chǎn)率14.0%；金穗607折合產(chǎn)量8585.9kg/hm2，較對照品種金穗3號增產(chǎn)13.7%；金穗606較對照品種金穗3號增產(chǎn)12.4%。
張雷等人[5]認為全膜雙壟溝播栽培玉米可在海拔2300m以內(nèi)的區(qū)域內(nèi)種植。本試驗通過對供試玉米品種的性狀、生育期及產(chǎn)量結(jié)果進行綜合分析，建議在安定區(qū)海拔2100～2300m區(qū)域擴大武科早304、武科早303、金穗607及金穗606的種植面積，其他品種可在海拔2100m以下區(qū)域進一步試驗。
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1.1小桐子JcMSRA基因全長cDNA的克隆以小桐子葉片材料提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，擴增JcMSRA基因cDNA全長序列。結(jié)果表明，擴增得到的產(chǎn)物約0.9kb(圖1A)。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR驗證陽性克隆(圖1B)。挑取陽性克隆過夜搖菌，提取重組質(zhì)粒pEASY-T1-JcMSRA(圖1C)，并以M13通用引物進行測序。
1.2小桐子JcMSRA基因的生物信息學分析經(jīng)測序分析，本研究克隆的小桐子JcMSRA基因的cDNA序列全長879bp，包含一個完整的開放閱讀框(780bp)，編碼259個氨基酸(圖2)。通過將JcMSRA編碼框與其基因組序列(Jcr4S03665,14648~16350位,1702bp)比對，發(fā)現(xiàn)JcMSRA基因包含2個外顯子(長度分別為528bp與252bp)與1個內(nèi)含子，且內(nèi)含子的序列(924bp)較2個外顯子都長，符合AT/GT的剪切規(guī)則。ProtParam分析結(jié)果顯示，JcMSRA編碼的蛋白質(zhì)分子量為29.1kD，理論等電點為8.75，且單體亞基不穩(wěn)定，說明其屬于多聚體蛋白質(zhì)。另外，該蛋白質(zhì)N端不含信號肽，預測其亞細胞定位可能性最大的為線粒體、其次為細胞核。ExPASy的COILS預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)在190~220位有一個明顯的卷曲螺旋區(qū)域(圖3A)。作為一種超二級結(jié)構(gòu)，卷曲螺旋一般由2~7個短的琢-螺旋組成，是許多轉(zhuǎn)錄因子與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)元件，該卷曲螺旋出現(xiàn)的位置正好是其二級結(jié)構(gòu)中琢-螺旋最長的部位，與SOPM服務器預測的結(jié)構(gòu)吻合(圖3B)。分別以大腸桿菌(Escherichiacoli)、釀酒酵母(Sa-ccharomycescerevisiae)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicatruncatula)、毛果楊(Populustrichocarpa)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)與小桐子MSRA氨基酸序列進行多重序列比對(圖4)，發(fā)現(xiàn)MSRA氨基酸序列在N端與C端都沒有同源性，差異變化較大，而在中部相對保守。MSRA屬于單結(jié)構(gòu)域蛋白，位于該酶蛋白活性中心的核心氨基酸殘基為Phe102、Trp103、Tyr132、Glu144、Tyr184(圖4,菱形標注)，而-GCF-W-保守序列的Cys與C端的兩個保守Cys殘基主要起維持酶活性中心結(jié)構(gòu)的功能。將小桐子MSRA氨基酸序列進一步與MSR家族的三類不同(MSRA,MSRB,fRMSR)的MSR氨基酸序列進行多重序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5)。由圖中可以看出，不同的MSR被聚類為明顯的三條分支，印證了MSR三個家族在氨基酸一級序列及高級結(jié)構(gòu)等方面的進化差異性。我們得到的小桐子MSR被歸入了MSRA分支中，與小桐子的近科物種毛果楊(Populustrichocarpa)在進化上距離較遠，序列相似性僅為22.19%，而與蕓豆(Phaseolusvulgaris)、棉花(ssypiumbarbadense)、油菜(Brassicanapus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的親緣關(guān)系較近，序列相似性分別為70.30%、68.82%、61.65%、60%。目前，通過X-晶體射線衍射法已經(jīng)獲得了幾種(如大腸桿菌,毛果楊,牛)MSRA的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。我們通過同源建模方法構(gòu)建了小桐子MSRA的三維空間結(jié)構(gòu)并進行了氨基酸殘基能量評估(圖6)。綜合研究MSRA的晶體結(jié)構(gòu)顯示，其表面都有一個口袋狀結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)周圍的氨基酸殘基相對保守，后被證實是底物甲硫氨酸亞砜的結(jié)合位點。小桐子MSRA蛋白的底物結(jié)合位點氨基酸構(gòu)成為Tyr132、Glu144、Tyr184，另外，-GCFW-保守序列中的最后兩位氨基酸Phe102、Trp103也參與了催化中心的形成(圖6A)，而-GCFW-保守序列結(jié)構(gòu)域中的Cys101以及C端的保守Cys251、Cys257在維持結(jié)合位點空間結(jié)構(gòu)方面也是不可或缺的。Ramachandram能量圖分析顯示有96.9%的氨基酸殘基處于能量穩(wěn)定區(qū)域，說明預測的三維結(jié)構(gòu)可信(圖6B)。小桐子MSRA空間結(jié)構(gòu)核心區(qū)域是3段琢-螺旋包裹的6條茁-折疊片層結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)琢/茁卷狀，二級結(jié)構(gòu)組成順序以茁1-琢1-茁2-茁3-琢2-茁4-琢3-茁5-茁6排列，并且茁1與茁6較短，而核心4條茁-折疊較長，在拓撲結(jié)構(gòu)上排列為反平行方式。另外，在茁2與茁3之間有1段極短的琢-螺旋，在琢2與茁4之間存在2條反平行的極短茁-折疊與1段極短琢-螺旋，而在靠近N末端還存在1段極短琢-螺旋，C端存在2段極短琢-螺旋。蛋白質(zhì)核心區(qū)域被兩端柔性區(qū)包裹，包括N端的92個氨基酸殘基(Met1-Glu92)與C端的33個氨基酸殘基(Ala227-Gly259)。
2討論
甲硫氨酸亞砜還原酶作為生物體內(nèi)的抗氧化修復因子屬于多基因家族，目前已經(jīng)報道的甲硫氨酸亞砜還原酶有三個亞家族，不同家族雖然催化相似的反應，但沒有一級氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)相似性(Rouhieretal.,2006)。最早被報道的兩個亞家族是MSRA與MSRB，MSRA與MSRB能夠分別特異性地還原Met-S-SO與Met-R-SO，且兩者既可以催化游離的甲硫氨酸亞砜，也可以催化蛋白表面的甲硫氨酸亞砜。第三個MSR家族最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，命名為fRMSR(freemethionine-R-sulfoxidereductase)，而該酶只能催化游離的甲硫氨酸亞砜。MSRA最早從大腸桿菌中分離出來的，是一類相對較小的胞質(zhì)酶，編碼該酶蛋白的基因廣泛存在于生物界，如梭狀芽孢菌(Clostridiumsp.Ohilas)、金屬還原菌(Shewanellaoneidensis)、嗜熱古生菌(T.kod-akaraensis)、酵母菌、擬南芥、楊樹、果蠅、小鼠、大鼠及人。該亞家族不同種屬間同源性不高，但其催化部位的氨基酸序列是非常保守的。在N端存在一個保守序列-GCFWG-(尤其是中心的Cys)，這一序列的突變將導致MSRA完全失活；另外，在C端存在兩個保守的還原型Cys殘基，以上三個保守的Cys在空間結(jié)構(gòu)上共同參與MSRA催化中心的構(gòu)成(Rouhieretal.,2007)。MSRB最初也是從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，且在黃單孢菌(Xanthomonascampestris)、梭狀芽孢菌(Clostriidiumsp.Ohila)、擬南芥、煙草、果蠅及人等生物體中都存在，屬多基因亞家族，在不同生物體(如人,小鼠等)中一般都有3個MSRB，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體，其N端定位信號肽在不同的MSRB中較為保守。MSRB在其N端同樣存在-GCGWP-保守序列，除此之外，大部分MSRB在其C端僅存在一個保守的Cys殘基(Dingetal.,2007)。與MSRA不同，MSRB中還包含兩個-CXXC-保守序列，用于結(jié)合Zn2+或Fe2+，共同構(gòu)成MSRB的活性中心(Olryetal.,2005)。
目前關(guān)于MSRA與MSRB的表達、調(diào)控及作用機理的研究主要集中在微生物及動物中，如大腸桿菌、酵母菌、小鼠及人等，而對于植物MSR的研究報道近幾年才逐漸增多，本研究中克隆的小桐子MSRA基因也是首次報道。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中至少存在5個編碼不同形式的MSRA基因AtMSRA1-At-MSRA5，同時存在至少9個MSRB基因AtMSRB1-AtMSRB9；另外，在毛白楊中發(fā)現(xiàn)9個MSR基因，包括5個MSRA與4個MSRB；在水稻中發(fā)現(xiàn)4個MSRA與3個MSRB基因。利用在線軟件預測發(fā)現(xiàn)，不同的MSR在植物細胞中有不同的定位，目前發(fā)現(xiàn)的包括細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌型MSR等(Rouhieretal.,2007)。芯片數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)都表明不同亞細胞定位的MSR有著不同的組織表達模式，胞質(zhì)型MSR通常在所有組織器官中都有表達，葉綠體型MSR主要在綠色組織尤其是葉中表達。Romero等(2004)通過RT-PCR分析了擬南芥不同MSR類型的組織表達特異性，結(jié)果表明，AtMRA4在除根以外的所有組織中的表達量都很豐富，其總表達量在所有MSRA中也是最高的；AtMSRA2和AtMSRA3表達量僅次于AtMSRA4，且主要在根和莖中表達；而AtMSRA1和AtMSRA5在所有組織中的表達量都很少；AtMSRB2、AtMSRB6的表達量在葉和其它綠色部位中最高，而AtMSRB5、AtMSRB7、AtMS-RB8、AtMSRB9則主要在根中高表達。大量數(shù)據(jù)表明，各種生物與非生物脅迫可以誘導高等植物不同MSR基因的表達，強光與鹽脅迫可以強烈誘導擬南芥質(zhì)體型AtMSRA4的表達(Gustavssonetal.,2002)。定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的AtMSRB3可清除在植物受冷脅迫時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累的MetSO和ROS，過表達AtMSR-B3可以提高擬南芥植株的耐寒性(Kwonetal.,2007)。而水稻OsMSRB1.1在受到包括鹽、甘露醇、低溫、甲基紫精和ABA在內(nèi)的非生物脅迫時表達量上升，而高溫處理則會使OsMSRB1.1表達量下降(Guoetal.,2009)。以上事實說明MSR基因表達種類的多樣性與組織特異性、表達調(diào)控的復雜性以及與植物應答逆境脅迫的關(guān)聯(lián)性，同時也暗示其在植物抗逆性研究中的應用前景。
3材料與方法
3.1實驗材料及處理供試小桐子種子采自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的小桐子種子，用1.5%CuSO4消毒20min，無菌水漂洗5次，于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中吸漲24h(李忠光和龔明,2010)。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有5層用無菌水濕潤濾紙的白磁盤(24cm伊16cm)中，于相對濕度75%、晝夜溫度26/20℃、光周期16/8h的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5d。之后將發(fā)芽的種子播于消毒的培養(yǎng)土中并于同樣恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d至第二片真葉展開。取第二片真葉材料，液氮速凍后置于-80℃冰箱中用于RNA的提取。
3.2菌株與主要試劑大腸桿菌Trans1-T1(DH5琢)菌株由本實驗室保存；TransZolUp、DNase玉、TransStartTaqDNAPoly-merase、Amp、X-gal、IPTG、2伊EasyTaqPCRSuperMix(+dye)、TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix、EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPurePlasmidMin-iPrepKit、pEASY-T1CloningKit、Trans2KPlus域DNAMarker購自全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成和測序由深圳華大基因有限公司完成。
3.3實驗方法
3.3.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成取0.2g小桐子葉片材料，按照王海波等(2014)的方法利用TransZolUp試劑提取并純化總RNA。以AnchedOli(dT)18為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix合成第一鏈cDNA。
文章編號：1007-7847（2015）02-0119-05Bioinformatic Analysis of TATA-binding Protein of ZebrafishYANG Shao-bin， FENG Jing-wen， ZHAO Wen-cheng， WANG Zhao-song， XU Shi-lei*（Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital， National Clinical Research Center for Cancer， Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy， Tianjin 300060， China）Abstract ： TATA-binding protein （TBP） is important in the process of transcription initiation in zebrafish. By means of bioinformatic methods， TBP of zebrafish is illustrated and analyzed by physicochemical property， sequence homology among different species， conserved domains， transmembrane structures， hydrophilici ty/hydrophobicity， protein secondary structure， protein tertiary structure， as well as protein-protein interactions. The results showed that zebrafish TBP consists of 302 amino acids， with isoelectric point of 9.8. This protein belongs to the TBP superfamily without transmembrane structure， and it is a hydrophilic protein. The secondary structure analysis showed that it contained 5 a. helices and 8 f3 sheets and random coil was the major structure element. The reliability of predicted three-dimensional structure of zebrafish TBP was up to 98.9%. Further analysis proved that the predicted protein structure was stable. It showed that the 10 most relevant interaction proteins with the zebrafish TBP were all transcription factors or TF II D complex members. Therefore， the results provided great information about zebrafish TBP in transcription regulation for further research.Key words： zebrafish； TATA-binding protein； bioinformatics（Life Science Research， 2015，19（2）： 119?123）
TATA結(jié)合蛋白（TATA-binding protein，TBP）址一種特異性結(jié)合DNA序列上TATA框的轉(zhuǎn)錄因子。TATA序列存在于真核細胞基因啟動子中轉(zhuǎn)錄起始位點上游30個bp左右[1]。TBP與其他一些TBP相關(guān)蛋白共同組成廠TFⅡD復合物，TFⅡD是一種常見的轉(zhuǎn)錄因子，它是RNA聚合酶Ⅱ起始復合體的組成部分。TBP能夠幫助RNA聚合酶Ⅱ跨過轉(zhuǎn)錄起始位點。TBP在DNA雙鏈解鏈（double strand separation）的過程中也起到一定的作用，這是通過其能夠使DNA彎曲80°來實現(xiàn)[2-4]。TBP的另一個特點是含有一長串谷氨酰胺氨基酸殘基。這個區(qū)域調(diào)節(jié)TBP的C端和DNA的結(jié)合能力、轉(zhuǎn)錄復合體形成的比率以及轉(zhuǎn)錄的起始。斑馬魚屬于鯉科，鯉目。由于再生能力強的特性，斑馬魚經(jīng)常被當作研究脊椎動物的生物模型[5]。分析研究斑馬魚TBP有助于更好地理解斑馬魚基因轉(zhuǎn)錄過程。到目前為止，對斑馬魚TBP的生物學研究已經(jīng)有一定的進展，但是對其生物信息學分析還未見報道。為此，本研究采用生物信息學方法，對斑馬魚TBP的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、親水性/疏水性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、與其他物種親緣關(guān)系等進行預測和分析，為其后續(xù)研究奠定全面的理論基礎。1材料與方法1.1材料數(shù)據(jù)資料來源于UniProt網(wǎng)站已經(jīng)注冊的TBP氨基酸序列。其中TBP：斑馬魚zebrafish（Q7SXL3）、非洲爪蛙Xenopus laevis（ P27633）、小鼠Mouse（ P29037）、牛Bos taurus （Q2HJ52）、人Human（ P20226）。1.2方法利用ProtParam分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；蛋白序列同源性、多序列比對及序列系統(tǒng)進化樹分別由NCBI protein blast .ClustalX2.0、njplot等軟件實現(xiàn)；利用TMHMM、ProtScale分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和疏水性；NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫用來分析保守區(qū)域；Jpred、Swiss-Model和Structural Analysis and Verification Server分別預測蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)及其合理性。String則用來預測蛋白質(zhì)的相互作用。各軟件、數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息如表1。2結(jié)果與分析2.1斑馬魚TBP的理化性質(zhì)預測和分析使用ProtParam蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測網(wǎng)站對5種TBP進行理化性質(zhì)預測，得到結(jié)果如表2。結(jié)果顯示，TBP基因在5個不同物種中編碼的氨基酸個數(shù)在297～339之間；相對分子質(zhì)量在32702.8～37698.1之間；各物種TBP等電點差異其微，均在9.8附近，說明TBP是堿性蛋白質(zhì)；TBP在5個物種中的半衰期均達到了30h；5種蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明它們不是穩(wěn)定蛋白；各TBP的脂肪族系數(shù)在76.58～88.65之間；5種蛋白的平均疏水性均為負值，表明它們都是親水蛋白質(zhì)。2.2斑馬魚TBP的同源性預測和分析
中圖分類號：Q949.71
文獻標識碼：A
鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生的草本植物，鐵皮石斛含石斛多糖、石斛堿、雙芐酚類、菲酚類等多種藥效成分，是石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的種，具有滋陰清熱、潤肺止咳、益胃生津、明目強身等作用（Zhangetal，2000）。核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco）是存在于葉綠體內(nèi)的一個雙功能酶，同時催化卡爾文循環(huán)中最初固定CO2的反應以及光呼吸作用中的第一步反應，該酶處于光合碳還原和碳氧化兩個方向相反但又相互關(guān)聯(lián)的循環(huán)交叉點上，對凈光合速率起著決定性的影響，因此提高Rubisco活力是提高光合作用的重要途徑（潘瑞熾等，2004）。因鐵皮石斛原生地的生境破壞和常年的濫采亂挖，野生資源遭到嚴重的破壞，瀕臨滅絕，已列入中國珍稀瀕危保護植物的名錄。由于石斛不能夠栽培在土壤里，北方地區(qū)必須栽培在樹皮、木塊、鋸末等做的栽培床或者是石頭上，冬天多數(shù)需要蓋溫棚等設施，投資較大，加上石斛種植的技術(shù)要求高，目前市場尚未完全打開，發(fā)展速度還不是很快（張明等，2010）。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，許多糧食作物如大麥（Rundle&Zielinski，1991）、水稻（Toetal，1999）、大豆（Yinetal，2014）等植物的RCA基因被克隆，但目前報道的RCA基因很少有涉及藥用觀賞植物，最近有朱明庫等（2013）對羽衣甘藍Rubisco活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息學及表達分析的研究；袁秀云等（2016）對蝴蝶蘭Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低溫脅迫下的表達分析的研究；祝欽瀧等（2011）對彩葉草Rubisco活化酶基因SsRCA進行了組織表達特異性和光誘導表達特性研究；曾淑華等（2012）已從鐵皮石斛中克隆了光合碳途徑關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此，開展鐵皮石斛RCA基因研究顯得尤為必要。本研究為了提高石斛的質(zhì)量，提高石斛光合效率，揭示鐵皮石斛光合作用機理自然成了鐵皮石斛研究領域的重要問題，該研究利用RACE技術(shù)克隆出鐵皮石斛RCA2全長基因，并進行生物信息學分析，為進一步研究鐵皮石斛光合作用調(diào)節(jié)機理奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
鐵皮石斛原產(chǎn)地為貴州，現(xiàn)在種植于河南省鄭州市鄭州師范學院蘭花工程技術(shù)研究中心智能日光溫室，植物材料為一年生鐵皮石斛。
1.2方法
1.2.1RNA提取選取一年生鐵皮石斛葉片，液氮速凍，保存于-80℃冰箱備用。葉片總RNA提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen公司）；采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性；采用QuawellQ5000微量紫外可見分光光度計測定其A260/A280值及其濃度。
1.2.2RCA2基因全長的克隆以提取的葉片總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。根據(jù)GENBANK上已知植物的RCA保守區(qū)，利用DNAMAN和Primer5.0生物軟件設計兼并引物（表1），擴增RCA保守片段。PCR反應體系為20.0μL：10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMix2.0μL、上游引物RCAF1（10μmol·L1）1.0μL、下游引物RCAR1（10μmol·L1）1.0μL、模板cDNA1.0μL、rTaq酶（5U·μL1）0.2μL，加滅菌雙蒸水至總體積20.0μL；反應程序為94℃預變性5min；94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。切膠回收目的片段，連接pGEMTEasy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆送至上海英濰捷基生物技術(shù)公司測序，獲得RCA基因的保守區(qū)序列。再根據(jù)獲得的保守區(qū)序列，分別設計5′端和3′端特異性巢式引物（表1），以葉cDNA為模板，用巢式PCR方式分別擴增RCA的5′端和3′端序列，按Clontech公司SMARTerTMRACE擴增試劑盒操作說明進行反應，回收擴增目的產(chǎn)物，克隆到pGEMTEasy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，進行測序和拼接。
1.2.3ORF的擴增根據(jù)DNAMAN軟件拼接得到RCA基因序列全長，利用Premier5.0設計1對特異引物RCAF2和RCAR2（表1），用于完整開放閱讀框（ORF）的擴增。PCR擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，進行35個循環(huán)，72℃延伸15min。ORF片段連接到pGEMTEasy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序進行ORF序列驗證。
1.2.4生物信息學分析利用ORFfinder進行開放閱讀框的預測；利用NCBI上的BLAST進行基因相似性的分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast/）；利用DNAMAN進行氨基酸序列比對分析；利用ProtScale程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用TargetP軟件（UsingPLANTnetworks）和PSORTll（http：//psort.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位的分析；利用Protfun（http：//cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析預測RCA2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分類；利用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測；利用ExPASy網(wǎng)站上的SWISSMODEL進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預測分析。
2結(jié)果與分析
2.1RCA2基因全長克隆
葉片總RNA提取后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，檢測結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，A260/A280值1.96，濃度為210.56ng·μL1。
以鐵皮石斛葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以兼并引物RCAF1和RCAR2進行保守區(qū)片段PCR擴增，得到一個503bp保守片段（圖1：B），根據(jù)設計的3′端和5′端特異引物，采用RACE技術(shù)，擴增獲得3′端目的片段（圖1：D）和5′端目的片段（圖1：C）。利用生物軟件DNAMAN進行序列拼接得到該基因的全長為1730bp，利用ORFfinder分析，共有9個ORF，該基因最長的ORF共計1323bp，包含81bp的5′UTR、326bp的3′UTR，編碼440個氨基酸，將該基因命名為RCA2，GenBank登陸號為KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2擴增獲得1323bpORF片段（圖1：A），連接到pGEMTEasy載體上測序驗證，得到的陽性質(zhì)粒命名為pGEMRCA2。
2.2RCA2基因全長的生物信息學分析
2.2.1RCA2核苷酸及編碼蛋白序列的理化性質(zhì)利用blastp和DNAMAN對RCA2氨基酸序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因包含PloopNTPaseSuperfamily結(jié)構(gòu)域，分別為“WGGKGQGKS”（A區(qū)）和“GKMCCLFINDLD”（B區(qū)），屬于PloopNTPase超家族基因（圖2）。理化性質(zhì)分析該蛋白的分子質(zhì)量為48.53kDa，等電點為6.19。將該基因全長核苷酸序列在NCBI上進行blastn相似性比較，結(jié)果表明基因均為RCA基因，且與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的相似性高達87%。氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與蝴蝶蘭、葡萄、荷花的相似性分別為89%、84%、85%（圖3）。
2.2.2RCA2編碼蛋白質(zhì)的親疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的親疏水性發(fā)現(xiàn)，RCA2蛋白質(zhì)序列具有較高的親水性，其中第69位的Thr親水性最強（-3.078），第162位Leu的疏水性最強（2.122）（圖4）。
2.2.3RCA2編碼蛋白質(zhì)的亞細胞定位蛋白的亞細胞定位與該蛋白所執(zhí)行的功能是密切相關(guān)的，用TargetP和PSORTII軟件進行亞細胞定位分析，TargetP預測結(jié)果顯示RCA2蛋白定位于葉綠體基質(zhì)，可信度為3（圖5：A），用PSORTII預測蛋白顯示，RCA2蛋白定位于葉綠體基質(zhì)、線粒體基質(zhì)間隙、葉綠體類囊體膜、葉綠體類囊體腔，RCA2蛋白主要存在于葉綠體基質(zhì)（圖5：B）。
2.2.4RCA2編碼蛋白質(zhì)的功能預測與分析利用ProtfunsoftwareofCBS分析預測RCA2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分類，可能有意義的功能包括中間代謝、脂肪酸代謝、翻譯、輔酶因子的生物合成和能量代謝等，他們的幾率分別是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。這表明RCA2在中間代謝起到了一個非常重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯中起到了重要作用，在輔酶因子的生物合成和能量代謝中也起到了關(guān)鍵作用。
2.2.5RCA2編碼蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)預測采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果表明，α螺旋占30.68%，延伸鏈占25.45%，不規(guī)則折疊占43.86%（圖6）。用ExPASy網(wǎng)站上的SWISSMODELWorkspace預測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以4w5w.1.A（SMTLid）為模板進行建模，該模板以XRAY2.90方法產(chǎn)生，與RCA2蛋白一致性為86.02%（圖7）。
3討論與結(jié)論
中圖分類號 S662.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）06-0081-04
Analysis on Insilico Cloning and Bioinformatics of Vaccinium corymbosum UFGT Gene
XIN Xiao-juan 1 MA Wei 2 * LI Yu-cheng 3
（1 Daxing′ anling Academy of Agriculture and Forestry in Heilongjiang Province，Daxing′ anling Heilongjiang 165000； 2 Heilongjiang University of Chinese Medicine； 3 Daxing′ anling Forestry Administration）
Abstract [Objective]Using electronic cloning technology to predict UFGT gene of Vaccinium corymbosum.[Methods]Taking Vaccinium uliginosum UFGT sequence as the probe sequence，based on EST sequence from NCBI and assembled by CAP3 sequence assembly programme，using bioinformatics database and related software to predict the structure and function analysis.[Results]The full length of UFGT gene was 1 789 bp and it contained a 1 161 bp ORF，encoding 386 amino acid and the protein is a hydrophilic protein.[Conclusion]The study can provide theoretical and experi-mental basis for further explain of molecular genetic function.
Key words Vaccinium corymbosum；UFGT；insilico cloning；bioinformatics
高叢越桔（Vaccinium corymbosum）原產(chǎn)地為北美，是杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）木本植物，比^適合在中國北方地區(qū)栽培，是經(jīng)濟價值最高的優(yōu)良品種，因其果實大、品質(zhì)佳、口感好深受人們青睞[1]。
類酮類化合物在高等植物界分布廣泛，可以參與花、葉片及果實等顏色的形成，還具有抗炎、抗癌、抗氧化和保護心腦血管系統(tǒng)等多種藥理作用[2]。植物中的類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）處于類黃酮合成途徑中，形成各種花色苷[3]。目前，科研人員已在葡萄、玉米、水稻、草莓、荔枝等植物上對UFGT基因進行了分析研究[4-5]。
電子克隆是一種基因克隆方法，具有高效、快速、投入低，并可以為實驗克隆提供精準的參考序列等優(yōu)點[6-8]。
本研究基于電子克隆技術(shù)，對預測的高叢越桔的UFGT基因進行序列分析，從理化性質(zhì)、亞細胞定位、氨基酸組成、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域等方面對該基因編碼的蛋白進行了預測，以期為進一步解釋基因的分子功能奠定理論及實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 電子克隆獲得新基因序列
以篤斯越橘UDP-glucose：flavo-noid 3-O-glucosyltran-sferase（UFGT）基因（KP218512）作為探針，使用Blastn工具檢索NCBI中與探針序列同源性較高的高叢越桔EST序列，使用在線工具CAP3[9]進行拼接，以拼接好的重疊群（Contig）為探針，再次Blast檢索，如此反復。
1.2 生物信息學分析
對預測的高叢越桔UFGT基因序列進行分析，具體在線生物信息學軟件如表1所示。
2 結(jié)果與分析
2.1 新基因的識別
以篤斯越橘UDP-glucose：flavo-noid 3-O-glucosyltran-sferase（UFGT）基因（KP218512）為探針，獲得全長為1 789 bp的Contig 1條，其開放閱讀框長度為1 161 bp，編碼386個氨基酸，具體見圖1。
2.2 高叢越桔UFGT基因編碼氨基酸一級結(jié)構(gòu)預測
蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列，是蛋白質(zhì)研究的重要組成部分。基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，通過在線軟件ProtParam[10]，對高叢越桔UFGT基因編碼的氨基酸的一級結(jié)構(gòu)預測見表2。
2.3 高叢越桔UFGT信號肽預測和分析
蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運主要依靠信號肽指導。采用SignaIP-4.1 Server[11]，預測高叢越桔UFGT的信號肽，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯邊苍浇踀FGT基因所編碼的蛋白質(zhì)不存在信號肽，該蛋白不進行轉(zhuǎn)運。
2.4 高叢越桔UFGT蛋白疏水性/親水性分析
對高叢越桔UFGT編碼的氨基酸用ProScale在線軟件[12]進行親疏水性預測，一般負值越大表示蛋白親水性越強，正值越大疏水性越強，結(jié)果如圖3所示。可以看出，高叢越桔UFGT編碼的蛋白為親水性蛋白質(zhì)，最小值-1.476，最大值1.205，這與一級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果一致。
2.5 高叢越桔UFGT蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預測
生物膜功能的主要承擔者為膜蛋白。通過在線跨膜蛋白結(jié)構(gòu)預測TMpred軟件預測其蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向，結(jié)果如圖4所示。可以看出，該蛋白中存在3個跨膜區(qū)，即32-51、86-104、249-270氨基酸位置。
2.6 高叢越桔UFGT蛋白的亞細胞定位
蛋白質(zhì)由位于細胞質(zhì)中的核糖體合成之后，需要轉(zhuǎn)運到合適的位置才能正常行使其功能?；诘鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫，使用Psort在線軟件[13]對高叢越桔UFGT蛋白進行亞細胞定位，具體結(jié)果見圖5?？梢钥闯觯摰鞍自诩毎|(zhì)和線粒體的概率是39.1%，在細胞核的概率是13.0%，在細胞液中有8.7%的概率，可能主要分布于細胞質(zhì)和線粒體中。
2.7 高叢越桔UFGT蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測
蛋白質(zhì)中約85%的殘基處于3種穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，即α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。二級結(jié)構(gòu)預測的目的是根據(jù)一級結(jié)構(gòu)判斷殘基是否處于特定二級結(jié)構(gòu)?；诘鞍讛?shù)據(jù)庫，通過在線軟件SOPMA[14] 對高叢越桔UFGT蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，具體結(jié)果見圖6?？梢钥闯觯摰鞍踪|(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由4種形式組成，即由α-螺旋占41.97%，無規(guī)卷曲占30.57%，延伸鏈占17.88%，β-轉(zhuǎn)角占9.59%。據(jù)此推測，α-螺旋是高叢越桔UFGT蛋白二級結(jié)構(gòu)中數(shù)量最多的結(jié)構(gòu)元件。
2.8 高叢越桔UFGT蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測
采用同源建模法，利用SWISS-MODEL在線軟件[15]對高叢越桔UFGT蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測，具體結(jié)果見圖7?？梢钥闯?，該蛋白主要有無規(guī)則卷曲、α-螺旋2種結(jié)構(gòu)，同時還伴隨著延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角2種結(jié)構(gòu)，基本與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致。
2.9 蛋白質(zhì)磷酸化位點分析
蛋白質(zhì)翻譯后有精氨酸甲基化、磷酸化、ADP核糖基化、糖基化等多種修飾形式，其中，磷酸化是一種重要的共價修飾方式。利用NetPhos 3.1 Server在線軟件分析[16]的具體結(jié)果見圖8。可以看出，有15個絲氨酸（Ser）、10個蘇氨酸（Thr）、1個酪氨酸（Tyr）可能成為蛋白激酶磷酸化位點。
3 結(jié)論與討論
目前，越桔具有較高的營養(yǎng)價值，且藥理作用正逐漸被人們認識[17]。越桔含有豐富的多酚類物質(zhì)，如黃酮醇、酚酸和花青素。其中黃酮醇具有降低心血管和退化性疾病的風險能力[18]?；ㄇ嗨乇蛔C明具有減輕炎癥、降低血糖、影響脂質(zhì)代謝和脂肪沉積、減少大分子的氧化損傷[19]等作用。
通過電子克隆技術(shù)預測高叢越桔UFGT基因，全長為1 789 bp，開放閱讀框長度為1 161 bp，編碼386個氨基酸。該蛋白為親水性的非分泌蛋白，且其中存在一處跨膜區(qū)。該蛋白主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲構(gòu)成的二級結(jié)構(gòu)，在細胞質(zhì)和線粒體中分布的可能性最大，有15個絲氨酸（Ser）、10個蘇氨酸（Thr）、1個酪氨酸（Tyr）可能成為蛋白激酶磷酸化位點[20-21]。通過本研究預測的結(jié)果，為未來UFGT基因在高叢越桔中提取、克隆及基因功能方面的研究奠定基礎，同時也為電子克隆技術(shù)的廣泛應用提供參考。
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【關(guān)鍵詞】 甲胎蛋白;鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽;真核表達載體;肝腫瘤
Abstract: ? Objective: To construct a gene-modified hepatocellular carcinoma?(HCC)?specific AGAP expression vector regulated by the cis-acting element of AFP. The physicochemical property and structural characteristics of the protein were analyzed and predicted by computer-aided analysis to establish a basis for exploring biotoxin thepapy for tumor. Method:?The AGAP DNA fragment was amplified through RT-PCR from the total RNA of Chinese Buthus Martensii Karsch. It was then cloned into the plasmid pGL3/AFP. The recombinant plasmid pAFP-AGAP was identified by restriction endonucleases and nucleotide sequence. The protein analysis software were utilized to predict the flexibility，hydrophilicity，and antigenicity of the new AGAP protein. Then the expression levels of AGAP mRNA were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction?(RT-PCR)?after the recombinant plasmid being transfected into HepG2 cell line. Results:?Through the analysis of the software，?it could be found that the secondary structure of the new AGAP didn’t almost changed and remain their biologic activity. The recombinant plasmid was successfully to express AGAP mRNA in HepG2 cell line. Conclusion:?The recombinant vector is constructed successfully.
Key words: ?alpha fetoprotein;analgesic-antitumor peptide;eukaryotic expression vector; hepatocellular carcinoma
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，是我國癌癥患者病死率最高的疾病之一。手術(shù)、放化療及介入等常規(guī)治療效果均不理想，不能從根本上改善患者的預后。目前，利用基因工程的手段，實現(xiàn)AFP轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列驅(qū)動目的基因表達，對肝癌進行基因治療，是肝癌治療的熱點[1]。另外，蝎毒是一種毒性僅次于蛇毒的生物毒素，早在宋代全蝎就被用于治療驚厥、癲癇及腫瘤等疾病。很多人試圖從蝎毒中提取有抗腫瘤活性的組分，開發(fā)有效的、相對毒副作用較小的新藥。近年來，東亞鉗蝎毒(Buthus martensii Karsch)的藥用研究是我國生物毒素方面研究和開發(fā)的熱點之一。東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽(Analgesic-antitumor peptide，AGAP)就是從東亞鉗蝎毒中分離出的一種有效的抗腫瘤成分，對多種腫瘤細胞有細胞毒作用，并對動物移植癌有抑制作用[2-3]。本實驗利用基因工程手段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，實現(xiàn)AGAP細胞內(nèi)直接表達，省去了蝎毒分離、純化等繁瑣步驟，為進一步研究其在肝癌基因治療中的作用奠定了基礎。
1??材料和方法
1.1??材料??攜帶有效AFP啟動子和增強子組合的質(zhì)粒pGL3/AFP由Cheng Qian(Fundación para la Investigación Médica Aplicada)構(gòu)建饋贈。菌株DH5α和人肝癌細胞(HepG2)由本室凍存。RNA提取試劑(RNAiso Reagent)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BCa BESTTM RNA PCR Kit Ver 1.1)購自大連寶生物公司，各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，質(zhì)粒提取試劑盒(EZ Spin Col-umn Plasmid DNA Minipreps Kit)購自BBI公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司，DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，胰酶購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司。
1.2??引物設計??根據(jù)GeneBank中AGAP(AF464898)能表達66個成熟肽的基因序列及pGL3/AFP序列進行引物設計。AGAP基因上游引物順序為：5’- CATGCC ATGGCCGTACGCGATGGTTATATTGCCG -3’，引入了Nco I酶切位點，下游引物順序為：5’- TGCTCTAGAGACCG CCATTGCATTTTCCTG -3’，引入了Xba?I酶切位點，酶切位點已含起始密碼和終止密碼。
1.3??AGAP基因克隆??取新鮮的蝎尾，抽提RNA，按試劑盒步驟操作。利用RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA第1鏈，引物采用Oligo dT，條件為：65 ℃ 1 min、30 ℃ 5 min、65 ℃ 20 min、98 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。采用高保真Taq酶進行隨后的PCR反應。PCR條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，28個循環(huán)，末次72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物電泳，后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收待用。
1.4??pAFP-AGAP真核表達載體構(gòu)建及鑒定??取質(zhì)粒pGL3/AFP用Nco?I和Xba?I雙酶切，將所需載體片段4?188 bp經(jīng)電泳分離出并回收。膠回收的AGAP基因片段經(jīng)Nco?I和Xba?I雙酶切，獲目的基因201 bp與所需載體片段4?188 bp按3:1的比例混合，加入T4 DNA連接酶進行連接反應，16 ℃過夜。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，擴增后質(zhì)粒提取試劑盒提取。新構(gòu)建重組真核表達載體pAFP-AGAP(見圖1)酶切鑒定并測序。雙向測序由華大基因完成。
1.5??生物信息學分析??DNA測序驗證重組質(zhì)粒pAFP-AGAP的方向性和正確性，雙向序列測定由華大基因公司完成，測序結(jié)果使用Gene bank Blast進行比對;采用Vector NTI軟件對pAFP-AGAP序列進行讀框(ORF)分析，然后用Translation程序推導并輸出氨基酸序列;應用expasy.org網(wǎng)站提供的ProtParam方案以及DNAStar軟件中的Protean程序進行蛋白理化性質(zhì)分析。
1.6??重組質(zhì)粒實現(xiàn)細胞表達??HepG2細胞復蘇后置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃，體積分數(shù)5 %CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，用新鮮無抗性培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×105/mL，以每孔2 mL接種于6孔板培養(yǎng)過夜。次日將質(zhì)粒pAFP/AGAP與脂質(zhì)體(g/L)以1:3比例混合后轉(zhuǎn)染HepG2細胞，按LipofectamineTM 2000說明書操作。轉(zhuǎn)染后24 h，Trizol提取每孔細胞的RNA。RT-PCR 法檢測AGAP mRNA表達(條件同上)，其擴增產(chǎn)物電泳并測序鑒定。雙向測序由華大基因完成。
2??結(jié)果
2.1??AGAP基因克隆??提取的總RNA A260/A280比值為1.82，表明總RNA較純。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用設計的引物進行PCR擴增，所得特異性條帶208 bp與預期長度相符(見圖2)。
2.2??重組質(zhì)粒酶切鑒定??重組質(zhì)粒pAFP-AGAP經(jīng)Nco?I和Xba?I雙酶切為201 bp和4?149 bp兩片段，Xba?I單酶切符合4?395 bp大小，還用Kpn?I和Xba?I雙酶切pAFP-AGAP便于觀察，得3?081 bp和1?308 bp兩個片段(見圖2)。
2.3??生物信息學分析??pAFP-AGAP經(jīng)雙向測序結(jié)果證實融合基因插入方向正確，經(jīng)Gene bank Blast比對，有98%的堿基與GenBank序列相同，部分不同可能由基因突變或者基因克隆過程中錯配引起。結(jié)果顯示AGAP基因序列與原設計相符。重組質(zhì)粒Vector NTI讀框分析表明，含AFP順式作用元件的真核表達載體pAFP-AGAP下游插入了完整的目的基因AGAP，起始密碼ATG，終止密碼TAG，編碼68個氨基酸。ProtParam分析顯示，該AGAP蛋白分子量：16?355.9 Da，等電點：5.36，分子式： C606H1010N204O257S34，半衰期： 30 h(哺乳動物)，不穩(wěn)定系數(shù): 20.97，該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白。DNAStar軟件中的Protean程序分析，本實驗所表達的AGAP蛋白與GeneBank中AGAP蛋白，雖然序列有兩個堿基不同，并未完全正確表達增加的堿基數(shù)，但柔性、親水性、抗原性未發(fā)生改變，也沒有新的表位出現(xiàn)，二級結(jié)構(gòu)也基本相同(見圖3)。因此，我們可以預測pAFP-AGAP能正確表達AGAP，并與傳統(tǒng)蛋白分離后的AGAP成分有相同的效果。
2.4??RT-PCR方法測重組質(zhì)粒在細胞中的表達??電泳結(jié)果(見圖4)顯示HepG2細胞存在AGAP mRNA的表達，證實構(gòu)建的重組質(zhì)粒能正確讀碼并轉(zhuǎn)錄表達。
3??討論
從1968年Abelev將甲胎蛋白(AFP)作為肝癌的腫瘤標志物到現(xiàn)在，可謂歷史悠久。后來發(fā)現(xiàn)許多腫瘤標志物的表達受該腫瘤特異性順式作用元件或反式作用因子的調(diào)控，故可將目的基因置于此類腫瘤特異性調(diào)控序列的調(diào)控之下，使目的基因(特別是細胞毒性基因)在腫瘤細胞異性地表達，而不影響其他組織，可實現(xiàn)腫瘤的靶向基因治療。Kunitomi等[4]將白喉毒素片段A基因(DTA)連接在AFP啟動子下游，作用于肝癌組織， 結(jié)果肝癌細胞中DTA基因大量表達并促使腫瘤細胞死亡。但后來發(fā)現(xiàn)，用AFP基因全部5’-端序列作為調(diào)控，專一性不好。Ido等[5]研究發(fā)現(xiàn)，人300 bp AFP啟動子有效長度足以在人、大鼠細胞中啟動目的基因表達。由于AFP的表達很大程度上依賴于增強子的活性，一些研究者試圖利用其增強子的功能來增強轉(zhuǎn)染基因的表達。Kanai[6]將AFP基因的啟動子和增強子同時與自殺基因胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase，CD)基因融合，轉(zhuǎn)染肝癌細胞，使CD基因在肝癌組織特異性高效表達。
此外，傳統(tǒng)的中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)機體免疫功能方面有著西藥無可取代的作用，是很好的抗腫瘤藥物。其中，中藥蝎毒廣為應用，我國華南、華東地區(qū)的東亞鉗蝎也稱馬氏鉗蝎更是豐富。蝎毒成分復雜，AGAP是Liu等[7]分離純化得到的單組分活性肽，兼有抗腫瘤活性和鎮(zhèn)痛活性于一體。AGAP成熟肽含有66個氨基酸殘基，從一級結(jié)構(gòu)分析，推測是Na+離子通道抑制劑，但是AGAP具體的作用機制不明確。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，蝎毒對人低分化鼻咽上皮癌細胞株、B16黑色素瘤[8]、卵巢癌細胞HO-8910[9]、結(jié)腸癌細胞等多種惡性腫瘤都存在抑制作用?？滋旌驳萚2-3]也證實，蝎毒對人食管癌細胞、人喉癌細胞、人直腸腺癌細胞、人肝細胞癌細胞(SMMC-7721)、人胃癌細胞等多種人腫瘤細胞具有顯著的細胞毒作用，體內(nèi)動物實驗還發(fā)現(xiàn)可明顯抑制H22荷瘤小鼠腫瘤的生長。
考慮到以上的因素，本實驗正是利用含最短最有效AFP啟動子和增強子組合的質(zhì)粒pGL3/AFP來作為載體來構(gòu)建重組質(zhì)粒，實現(xiàn)高效的表達，為肝癌的基因靶向治療提供了有力工具。實驗結(jié)果顯示，我們構(gòu)建的重組質(zhì)粒pAFP/AGAP，軟件分析結(jié)果表明，所表達的目的蛋白α螺旋、β折疊等二級結(jié)構(gòu)，以及親水性、柔性、抗原性、表位等生物學活性幾乎未受到影響，而且所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后成功完成轉(zhuǎn)錄表達。因此，利用計算機輔助分析和預測蛋白質(zhì)的理化和結(jié)構(gòu)特征可使我們很好地了解所表達蛋白質(zhì)的生物功能，對進一步的研究具有一定的指導性，而且可節(jié)省很多的時間和開支[10]。
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中圖分類號：S565.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2930-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.056
蓖麻（Riciuns communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricicuns）一年或多年生雙子葉植物，廣泛生長在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是世界十大重要油料作物之一[1]。植物種子中有一種儲存營養(yǎng)物質(zhì)的細胞器――油體[2-4]，其內(nèi)部主要成分為三酰甘油，外部則為磷脂單分子層及嵌入其內(nèi)的油體結(jié)合蛋白質(zhì)組成的半單位膜[5]。油體結(jié)合蛋白質(zhì)主要有三種――油脂蛋白質(zhì)、油體鈣蛋白質(zhì)和油體固醇蛋白質(zhì)。油脂蛋白質(zhì)由N-和C-末端兩個親水區(qū)域及中間疏水錨定區(qū)域組成。N-和C-末端暴露在油體表面，能夠提供空間位阻和負電斥力來維持油體的穩(wěn)定[5]。Chen等[6]在油體中發(fā)現(xiàn)了3種微量蛋白質(zhì)分別稱為Sop1、Sop2、Sop3。Sop1稱為油體鈣蛋白質(zhì)。油體鈣蛋白質(zhì)由N-端親水鈣結(jié)合區(qū)域、C-端親水性磷酸化區(qū)域和中間疏水錨定區(qū)域組成，可能在油體成熟、脂肪動員和提高油體穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[5]。Sop2、Sop3被稱為油體固醇蛋白質(zhì)-A和油體固醇蛋白質(zhì)-B[7]。油體固醇蛋白質(zhì)是一種羥基固醇脫氫酶，屬于SDR家族[8，9]。N-端的疏水區(qū)域由兩個親性α螺旋夾著一個疏水錨定結(jié)構(gòu)組成，在此疏水區(qū)域中部有Pro knob結(jié)構(gòu)[10]，其余部位分為NADPH、固醇結(jié)合區(qū)域和兩者之間的活性位點S-（12X）-Y-（3X）-K[10]。Sop3和Sop2蛋白質(zhì)的固醇結(jié)合區(qū)域不同[7]。近來發(fā)現(xiàn)油體蛋白質(zhì)也存在于根尖和芽等胚后組織中，推測在植物體內(nèi)還存在未被發(fā)現(xiàn)的信號轉(zhuǎn)導通路[8]。本試驗以擬南芥蛋白質(zhì)作“種子”在蓖麻的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索，結(jié)合關(guān)鍵字搜索方法對蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進行生物信息學分析，以期為該蛋白質(zhì)的鑒定提供參考。
1 材料與方法
1.1 蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫搜索
以“Steroid dehydrogenase”為關(guān)鍵字在蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫（http：///search.php）中搜索，下載基因、cDNA和蛋白質(zhì)序列；以6條擬南芥油體固醇蛋白質(zhì)[11]作為“種子”，分別在蓖麻數(shù)據(jù)庫（http：///search.php）中進行Blastp搜索，E設為1×10-30，獲得同源的油體固醇蛋白質(zhì)的基因、cDNA和蛋白質(zhì)序列，去除重復后，再利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域分析工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）對所獲得的蛋白質(zhì)家族進行鑒定，檢測是否有SDR（短鏈脫氫/還原酶超家族）的保守結(jié)構(gòu)域。
1.2 蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)生物信息學分析
蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)采用Protparam軟件進行預測；內(nèi)含子、外顯子組成采用Spidey軟件進行分析；疏水性/親水性采用ProtScal軟件進行分析；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析采用GOR4軟件進行分析；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域采用TMHMM 2.0 Server軟件；信號肽結(jié)構(gòu)采用SignalP4.1 Server軟件進行預測；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析與同源建模采用CPHmodels軟件和RasMol-Raindy軟件；進化樹的構(gòu)建采用軟件ClustalW2軟件和MEGA 4.1軟件，所有軟件使用的都是其默認值，部分分析軟件的網(wǎng)址見表1。
2 結(jié)果與分析
2.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析
2.1.1 氨基酸序列的理化性質(zhì)分析 通過綜合分析，最終獲得11條完整的蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)基因，見表2。利用在線分析軟件Protparam對10種油體固醇蛋白質(zhì)進行分析，得到其對應的氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果見表2。大部分蛋白質(zhì)成員外顯子數(shù)為3或6，氨基酸殘基數(shù)為317～352，分子量為35.286 0～39.918 9 kDa，等電點PI為5.35～9.57。不穩(wěn)定系數(shù)表明，有8種成員在植物內(nèi)可能階段性出現(xiàn)。親水性大部分都為正值，大部分成員都為親水蛋白質(zhì)。信號肽預測表明，這11個蛋白質(zhì)不存在信號肽。由于Slo11蛋白質(zhì)基因不完整，所以后續(xù)分析中只選擇其他10個蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)。
2.1.2 疏水性/親水性的預測和分析 采用ProtScale軟件對10個蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進行分析，結(jié)果（圖1）表明，以Slo1、Slo9為例，1～40區(qū)域有強烈的疏水性，可能為跨膜區(qū)域與油體內(nèi)部疏水的三酰甘油相接合處，其他區(qū)域無明顯規(guī)律。
中圖分類號：S792.153；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）09-1759-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.09.040
Bioinformatics Analysis of Five MYB Transcription Factors from Betula piatyphylla Suk.
JIN Qiu，YANG Miao，SHI Mei-wei，REN Ru-yi，WEI Ji-cheng
（College of Life Sciences and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang 157011，Heilongjiang，China）
Abstract：5 candidate MYB transcription factors were obtained from Betula platyphylla Suk. transcriptome datebase. The theoretical molecular weight（MW）， isoelectronic point（pI）， nuclear localization signal，transmembrane domain and amino acid conserved domain of 5 MYB transcription factors were predicted， amino acid sequence alignment and phylogenetic tree were contructed with the MYB transcription factors from Arabidopsis. The results indicated that 5 MYB transcription factors of birch were all belonged to R2R3 type MYB members according to amino acid sequence alignment. Phylogenetic construction showed that the 5 MYB transcription factors of birch were closely with MYB transcription factors related to stress resistance from Arabidopsis， which suggested that the 5 birch MYB members may function in stress resistance.
Key words：Betula platyphylla Suk.；MYB transcription factors；stress resistance
MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育、形態(tài)建成以及非生物脅迫等多種生物學過程。MYB轉(zhuǎn)錄因子在防蟲、耐高低溫、干旱、高鹽、調(diào)節(jié)開花轉(zhuǎn)型關(guān)鍵基因表達以及調(diào)控植株主根伸長通路等過程中起重要作用[1]。它是植物界轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，對植株抗逆性起關(guān)鍵作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，GhMYB11基因在黃萎病菌侵染，鹽、干旱和氧化脅迫反應處置后的棉花新苗葉片中表達明顯上調(diào)，表明GhMYB11基因在棉花生物和非生物脅迫反應中起關(guān)鍵作用[3]。GmMYB042基因在大豆的莖、根、根瘤、種子、花和莢果皮中均有表達，且在大豆中受到PEG、低溫、高鹽和輻射的誘導[4]。木薯R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子MeMYB63在葉面上有高強度抗旱反應，說明該基因?qū)Ω珊得{迫誘導下的表達調(diào)控起關(guān)鍵作用[5]。水稻R2R3-MYB類鹽脅迫表明OsMPS基因有調(diào)控植物激素和細胞壁合成的功效，該基因的表達受多種植物激素的誘導[6]。擬南芥AtMYB13基因受激素誘導后強烈表達，能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對病原細菌（PstDC3000）的基本防衛(wèi)反應。MYB15蛋白可以結(jié)合CBF基因啟動子的MYB元件，繼而調(diào)控抑制低溫相關(guān)基因的表達[7]。擬南芥AtMYB73基因可以通過影響水楊酸和茉莉酸抵抗病原菌丁香假單孢桿菌和核盤菌，從而在干旱脅迫中發(fā)揮作用[8]。AtMYB44在HrpNEa調(diào)控擬南芥預防桃蚜過程中起重要作用[9]。AtMYB44基因通過E1N2調(diào)控擬南芥對桃蚜與菜蛾的抗蟲性[9]。鄭博[10]通過基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)把擬南芥的AtMYB44基因轉(zhuǎn)導到揚麥158中，得到擁有良好耐寒、耐旱和抗鹽堿的優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因小麥。MYB轉(zhuǎn)錄因子在紅根甘肅桃抗根結(jié)線蟲機制中能夠經(jīng)過調(diào)控苯丙烷代謝途徑增長紅根甘肅桃根部花色素苷和其余類黃酮物質(zhì)的含量，從而抵抗根結(jié)線蟲侵染[11]。多年生黑麥草3個轉(zhuǎn)錄因子LpMYB1、LpMYB2和LpMYB3參與黑麥草對紫外、干旱、高鹽脅迫的應答和形態(tài)建成[12]。目前，MYB轉(zhuǎn)錄因子對植物作用的分子機理還不完全清楚。
3 小Y與討論
本試驗通過白樺5個MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列與擬南芥的MYB轉(zhuǎn)錄因子比對，經(jīng)過軟件Bio Edit和MEGA 5.1分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明白樺的5個R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子可能具有抗逆性。水稻OsmB3R-2基因在擬南芥中過表達后轉(zhuǎn)基因植株對凍害、干旱和高鹽的耐受性顯著提高[6]； Rahaie等[13]研究證明小麥TaMYBsduI轉(zhuǎn)錄因子是高鹽和干旱脅迫下的調(diào)控子，MdSIMYB1過表達能增強轉(zhuǎn)基因小麥抗逆境能力?？梢姡琈YB轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。
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中圖分類號：Q945．11；Q617文獻標識碼：A文章編號：0439－8114（2011）12－2558-05
Bioinformatic Analysis of PEPC in C3 and C4 Plants
WU Mei1，2，ZHANG Bian－jiang1，YANG Ping1，WANG Rong－fu2，CHEN Quan－zhan1
（1． College of Biochemistry and Enviromental Engineering，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing 211171，China；
2． College of Life Science，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China）
Abstract： To explore the functional differences between C3 and C4 PEPC， PEPC proteins of four different C3 and C4 plants were analyzed by various bioinformatic tools to predict the protein properties， such as amino acids composition， pI， domains， secondary and spatial structure； and the PEPC protein sequences of C3 and C4 plants were aligned． The results showed that the PEPC proteins were unstable and the secondary structures were mainly composed of random coil， indicating some differences between PEPCs of C3 and C4 plants． A highly homologous（99．7％） protein structure data 1JQO chain A was predicted by three－dimensional structure modeling of PEPC by ESyPred3D， thus facilitated the tertiary structure building of target sequence． The tertiary structure model of Zea mays PEPC was further checked by PROCHECK programmer， and showed that 94．2％ of the amino acid residues were located in the most favored regions in Ramachandran plot， indicating that the simulated three－dimensional structure of Zea mays PEPC was reliable．
Key words：C3 plant； C4 plant； PEPC； bioinformatics
與C3植物相比，C4植物具有光合效率高、CO2補償點低、幾乎沒有光呼吸等優(yōu)點，特別在強光、高溫、干旱等條件下，C4植物具有明顯的生長優(yōu)勢及較高的水分和營養(yǎng)利用率，生物學產(chǎn)量也較高［1］。C4途徑包含多種酶類如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）、NADP－蘋果酸脫氫酶（NADP－malate dehydrogenase，NADP－MDH）、NADP－蘋果酸酶（NADP－malic enzyme，NADP－ME）和丙酮酸磷酸二激酶（Pyruvate ortho－phosphate dikinase，PPDK）等，這些酶有效地固定外部及其光呼吸釋放的CO2［2］從而使加氧酶活性受到抑制，降低了氮素的消耗，提高了水分利用率，大大提高了光合生產(chǎn)力［3］。近年來與光合作用途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶的基因已分別從玉米、高粱和莧菜等C4植物中被克隆，并開展了C4基因的遺傳轉(zhuǎn)化工作［4］。值得注意的是，Ku等［5］首次成功地將玉米C4光合途徑的關(guān)鍵酶PEPC基因?qū)隒3作物水稻中，獲得了高表達的轉(zhuǎn)基因水稻株，有效地提高了PEPC活性。羅素蘭等［6］和張桂芳等［7］分別克隆了C4植物甘蔗和稗草PEPC基因并進行了功能驗證。Chen等［8］又成功地將玉米C4型PEPC基因?qū)胄←溨胁崿F(xiàn)有效表達，展示了轉(zhuǎn)光合關(guān)鍵酶PEPC基因改造C3作物的應用前景。
Hermans［9］在菊科黃花菊屬（Flaveria）中發(fā)現(xiàn)PEPC有C3型、類似C3型、類似C4型、C3－C4中間型、C4型等不同代謝類型，分析它們的PEPC基因，發(fā)現(xiàn)同源性極高，C4植物PEPC基因與C3植物PEPC基因有71％的同源性，由于表達量不同而活性高低不同。前人的研究表明玉米的PEPC有C4型、C3型和根型3種類型［10］；高粱的PEPC基因家族有3個成員CP21、CP28、CP46［11］；Flaveria的PEPC基因家族由ppcA、ppcB和ppcC 3個亞家族組成［12］。盡管PEPC也是C3植物中另一主要羧化酶，為三羧酸循環(huán)補充草酰乙酸起回補反應的功能，但以C3植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)，PEPC還不能完成CO2凈固定直接生成碳水化合物，因為三羧酸循環(huán)的碳與PEPC結(jié)合是一種損失，必須在CO2固定后再進入Calvin循環(huán)。而在C4和CAM植物中，PEPC介導β羧化反應，把CO2固定為草酰乙酸，后轉(zhuǎn)變?yōu)樗奶妓幔?3］。在結(jié)構(gòu)上除了N端有調(diào)節(jié)磷酸化的基團外，來源于不同生物的PEPC其反應機制本質(zhì)上是相同的［14］。但不同來源的PEPC在不同植物體內(nèi)有著不同的生化和生理特性，并致使光合作用產(chǎn)生較大的差異。通過對PEPC進行生物信息學的分析，來進行基因的結(jié)構(gòu)和功能的比較，預測產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和功能的差異，以期為將C4關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)入C3作物或者通過修飾C3作物的基因來改造C3作物，從而有效提高作物的光合生產(chǎn)力。
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1材料與方法
1．1供試材料
數(shù)據(jù)資料來源于National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已注冊的核酸序列及對應的氨基酸序列：玉米（Zea mays，AJ536629）；稗草（Echinochloa crus－galli，AY995212）；甘蔗（Saccharum officinarum，AJ293346）；高粱（Sorghum bicolor，XM＿002438476）；擬南芥（Arabidopsis thaliana，AY210895）；水稻（Oryza sativa，AF271995）；棉花（Gossypium hirsutum，EU032328）；大豆（Glycine max，AB008540）。
1．2試驗方法
利用生物信息學數(shù)據(jù)庫和互聯(lián)網(wǎng)上的軟件進行分析，用Protparam［15］分析PEPC基因編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點等理化性質(zhì)；在NCBI［16］上對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析；用SOPMA［17］預測其二級結(jié)構(gòu)；用PROSITE［18］分析蛋白質(zhì)功能；以ESyPred3D［19］程序預測三級結(jié)構(gòu)；利用檢測蛋白質(zhì)質(zhì)量結(jié)構(gòu)的軟件PROCHECK［20，21］對預測的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行分析。
2結(jié)果與分析
2．1PEPC一級結(jié)構(gòu)分析
2．1．1PEPC理化性質(zhì)分析用Protparam預測PEPC基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)［15］。這8種植物PEPC的理論推導半衰期為30 h（體外，哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞內(nèi)）；大于20 h（體內(nèi)，酵母細胞內(nèi)）；大于10 h（體內(nèi)，大腸桿菌）。C4植物總的帶負電殘基（Asp＋Glu）和總的帶正電殘基（Arg＋Lys）略低于C3植物，總的親水性平均系數(shù)（GRAVY）平均略高于C3植物，為－0．45～－0．30，預測該蛋白質(zhì)屬于親水性蛋白質(zhì)。C4植物不穩(wěn)定參數(shù)低于C3植物，但兩者均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。8種植物PEPC蛋白質(zhì)中含量較多的氨基酸基本相同，為Leu、Glu、Arg、Ala。其中排第三和第四的Arg和Ala的含量略有不同，在C4植物中排第五的為Gly或Val，而C3植物中則為Asp，所有植物都不含有Asx（B）、Glx（Z）、Xaa（X）。C4植物酸堿性氨基酸的比例略小于C3植物。C4植物中非極性氨基酸、極性氨基酸含量略高于C3植物（表1）。
2．1．2PEPC氨基酸序列分析利用DNAMAN［22］進行多序列比對，比較8種植物的氨基酸序列。參數(shù)選擇：完全比對；多重比對；空位開放罰分：10；空位延伸罰分：1；延遲趨異序列：30％；蛋白質(zhì)加權(quán)GONNET。蛋白質(zhì)空位參數(shù)試用親水罰分和殘基特異罰分。在C3和C4植物中不同的氨基酸位點共有22處，見圖1中用淺色或深色為背景的位點，其中“…”表示省略的氨基酸。據(jù)此將進一步研究這些氨基酸位點，觀察造成的空間結(jié)構(gòu)活性區(qū)域有無變化。
2．2PEPC二級結(jié)構(gòu)分析
用SOPMA對PEPC二級結(jié)構(gòu)進行預測，PEPC結(jié)構(gòu)元件以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主，延伸鏈和β-折疊散布于整個蛋白質(zhì)中。沒有發(fā)現(xiàn)如310 helix、Pi helix、Beta bridge、Bend region等其他結(jié)構(gòu)（表2）。對于一級結(jié)構(gòu)中C3、C4植物不同處，在進行二級結(jié)構(gòu)預測后，也發(fā)現(xiàn)有3處不同（圖1）。在圖1的陰影中，C4植物在E（谷氨酸）與S（絲氨酸）處表現(xiàn)為c（無規(guī)則卷曲）與h（α-螺旋）的鏈接、C3植物表現(xiàn)為E與S均為c，而之后的S與D（天冬氨酸）處為c與h的鏈接。C4植物在P（脯氨酸）到V（纈氨酸）之間均為c的鏈接，C3植物R（精氨酸）到V之間有兩個c變成了e（延伸鏈），C4植物在K（賴氨酸）和兩個Q（谷氨酰胺）之間是表現(xiàn)為兩個t（β-折疊）與e的鏈接，而C3植物KQE之間為兩個c和e的鏈接。分析這些二級結(jié)構(gòu)的不同，為以后的三級結(jié)構(gòu)的比對提供了基礎，還有利于進一步去研究是否由于這些位點的不同而造成了PEPC在C3和C4植物中的差異。
2．3PEPC氨基酸序列結(jié)構(gòu)域功能的分析
通過PROSITE分析，8種植物都具有兩個符合PEPC活性的位點［VTI］－x－T－A－H－P－T－［EQ］－
x（2）－R－［KRHAQ］（H是活性殘基位點）；［IVLC］－M－［LIVM］－G－Y－S－D－S－x－K－［DF］－［STAG］－G（K是活性殘基位點）和一個保守序列M－F－H－G－R－G－G－T－V－G－R－G－G－G－P－T－H－L－A－I－L－S－Q－P－P－［DE］－T－I－H－G－S－［LP］－R－V－T－V－Q－G－E－V－I－E－Q－S－F－G－E－E－H－L。說明這幾種植物中都具有PEPC活性，只是活性位點和保守序列的起始位點有所區(qū)別（表3），這應該是和它們的氨基酸序列起始位置有關(guān)。
2．4PEPC的三級結(jié)構(gòu)預測
將玉米PEPC氨基酸序列上傳到ESyPred3D的建模服務器中進行PEPC結(jié)構(gòu)的三維建模，預測得到一個同源性較高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)1JQO chain A，同源性為99．7％，符合同源建模條件，從而構(gòu)建目標序列的三級結(jié)構(gòu)（圖2）。
利用PROCHECK對模建結(jié)果進行檢測，作Ramachandran點圖，統(tǒng)計位于最適合區(qū)、附加允許區(qū)、一般允許區(qū)和不允許區(qū)殘基的比率。Ramachandran點圖能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)的主鏈中的phi和psi的二面角角度以圖示的方式顯示。最深色區(qū)域是最理想的phi角和psi角分布區(qū)域，而白色區(qū)域則為不合理區(qū)域。因而如果預測的蛋白質(zhì)殘基的二面角有90％以上位于最深色區(qū)域，則表明其有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。圖3是玉米PEPC蛋白質(zhì)的Ramachandran點圖，其中94．2％位于最適合區(qū)，5．7％位于附加允許區(qū)，0．1％位于一般允許區(qū)，沒有氨基酸位于不允許區(qū)域。從圖中可以看出，模擬得到的玉米PEPC蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基有94．2％位于Ramachandran點圖中合理區(qū)域，從理論上表明模擬得到的玉米PEPC的三維結(jié)構(gòu)是可靠的。
3討論
根據(jù)經(jīng)典的C4光合知識，C4植物有葉肉細胞和維管束鞘細胞的分化，進行C4光合途徑所必需的多酶系統(tǒng)分別定位于此兩類具有葉綠體的細胞中，而且C4光合途徑是受多基因控制且各基因獨立遺傳，C3植物存在的內(nèi)源的C4循環(huán)酶及轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，都具有明確的生理功能，因而通過個別基因的過量表達增加其產(chǎn)物的活性，不能在C3植物中建立起完整的C4循環(huán)，還可能干擾C3植物的正常代謝，因此，把C3植物轉(zhuǎn)化為C4植物是不可能的，但是Jiao等［23］通過轉(zhuǎn)PEPC基因，水稻具有了類似初級的C3－C4中間型的特征。用生物信息學方法對已知PEPC序列進行比對分析，從而對其結(jié)構(gòu)和功能進行推斷和預測，為我們將PEPC基因轉(zhuǎn)入C3作物以有效提高作物的光合生產(chǎn)力提供了盡可能多的信息，能為選擇合適的試驗方法提供理論參考，為進一步對該基因的功能研究提供線索。此外要培育類C4作物，進一步提高光合效率，可能需要Kranz結(jié)構(gòu)，以免光呼吸CO2的外溢，這些都有待進一步研究。
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